王 磊 李大主 艾 文 方葉青 謝培益 華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東省深圳市 58000； 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管內(nèi)科

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化會(huì)造成動(dòng)脈血管狹窄或梗阻，臨床上大多數(shù)會(huì)引發(fā)高血壓、高血脂、糖尿病等心腦血管疾病。心外膜脂肪聚集與心臟及冠狀動(dòng)脈四周，其中單核—巨噬細(xì)胞通過擴(kuò)散而作用于鄰近細(xì)胞的激素傳遞方式產(chǎn)生炎癥因子，聚集于上皮細(xì)胞，對纖維斑塊的形成十分重要[1]。炎癥因子是很多疾病產(chǎn)生和發(fā)展十分重要的中間物質(zhì)，可促進(jìn)冠狀動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化，其中PLA2、MMP-2是人體中十分多見的炎癥因子[2]。本文通過對EATV、PLA2、MMP-2水平進(jìn)行檢測，探討了這些因素對纖維斑塊穩(wěn)定性的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年2月—2019年3月在我院胸外科進(jìn)行外科手術(shù)的患者96例，其中冠心病患者53例(冠心病組)，心臟瓣膜病患者43例(瓣膜病組)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)無手術(shù)耐受力；(2)伴有其他各系統(tǒng)重大疾??；(3)會(huì)發(fā)生系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。所有患者均已知情本次研究。

1.2 方法

1.2.1 EATV檢測及纖維斑塊的測量:所有患者均進(jìn)行CT掃描，使用Volumer軟件對EATV進(jìn)行測量。在測量前5～10min，給患者靜脈注射CT碘對比劑，并口服硝酸甘油以使冠狀動(dòng)脈平滑肌松弛達(dá)到擴(kuò)張動(dòng)脈血管的目的，服用倍他樂克將心率控制在正常范圍的最低值。CT測量值為-250～30HU定義為脂肪組織，選取心外膜邊界，使用Volumer軟件生成所選區(qū)域的脂肪體積(em)。測量最狹窄血管的斑塊，各斑塊選擇3個(gè)不同的區(qū)域進(jìn)行逐一測量，按最小CT測量值進(jìn)行斑塊的分類，其中軟斑塊為42～47HU；纖維斑塊為61～112HU；鈣化斑塊為126～736HU。血管代償性擴(kuò)張通過相關(guān)指數(shù)阻抗指數(shù)(RI)進(jìn)行測量，倘若RI≥1則為血管代償性擴(kuò)張。

1.2.2 定量即時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)提取和純化脂肪組織總核糖核酸(RNA):選取術(shù)中提取的100mg脂肪組織，對其采用差速離心法，使用新型總RNA抽提試劑(TRIZOL)提取和純化總RNA，采用紫外光譜儀對總RNA的濃度和純度進(jìn)行檢測。使用反轉(zhuǎn)錄試劑將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)，將cDNA作為模板，將MMP-2和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為DNA片段的擴(kuò)增引物。按下述配比制作PCR緩沖液，20μl PCR反應(yīng)體系中包含了熒光染料(SYBR) 10μl、上游引物(Forward primer) 0.4μl、下游引物(Reverse primer)0.4μl、RT-qPCR擴(kuò)增儀染料0.4μl、cDNA 2μl和蒸餾水(dH2O)6.8μl，通過擴(kuò)增儀使用SYBR Green染料法檢測cDNA相應(yīng)基因的相對表達(dá)水平。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30s，95C°變性5s、60C°退火30s，循環(huán)40次。采用公式2-△△Ct,其中公式中△△Ct=(Ct目的基因-Ct管家基因)研究組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組，計(jì)算出目的基因的表達(dá)水平，分析MMP-2的相對表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)操作3次。

1.2.3 免疫印跡法(Westernblot)：用總蛋白提取試劑提取脂肪組織中的蛋白，用BCA蛋白質(zhì)檢測劑對其濃度進(jìn)行檢測。選取50μg的蛋白進(jìn)行電泳分離，之后將蛋白轉(zhuǎn)至甲醛浸泡過的聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上。使用三羥甲基氨基甲烷(TRIS)+氯化鈉(NaCl)+非離子型表面活性劑(tween20)，即TBST緩沖液室溫下密封2h,一抗(與特異性抗原進(jìn)行特異性結(jié)合的蛋白)為獲得滴度為1∶1 000的兔抗人MMP-2多克隆抗體，內(nèi)參獲得滴度為1∶2 000的兔抗人β-actin多克隆抗體，二抗(抗體的抗體)為辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的獲得滴度為1∶2 000羊抗兔(IgG)抗體；采用凝膠成像儀對蛋白凝膠成像及分析，用圖像處理軟件測定其灰度值，比較分析MMP-2的水平。

1.2.4 PLA2活性檢測：將手術(shù)中提取的1g脂肪組織加入2ml 0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行搗碎，以1 000r/min離心10min，提取清液層等待檢測。使用脂肪組織PLA2熒光定量檢測試劑采用ELISA法進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間進(jìn)行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率(%)表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，血管代償性擴(kuò)張獨(dú)立影響因素進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組脂肪組織中MMP-2 mRNA表達(dá)水平、MMP-2蛋白及PLA2水平水平比較 冠心病組心外膜脂肪中MMP-2 mRNA表達(dá)水平、MMP-2蛋白及PLA2水平顯著高于瓣膜病組(P<0.05)，而胸腔脂肪中MMP-2 mRNA表達(dá)水平、MMP-2蛋白及PLA2水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組患者中不同部位脂肪組織中不同蛋白的表達(dá)比較

注：與冠心病組比較，*P<0.05。

2.2 EATV、脂肪中炎癥因子與纖維斑塊穩(wěn)定性相關(guān)性分析 先行血管代償性擴(kuò)張的多因素分析，血管代償性擴(kuò)張與非血管代償性擴(kuò)張患者的BMI、LDL-C、高血壓數(shù)、EATV、纖維及鈣化斑塊體積比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示上述因素為發(fā)生血管代償性擴(kuò)張的相關(guān)因素，見表2；對血管代償性擴(kuò)張的多因素進(jìn)行Logistic回歸分析，EATV、MMP-2、高血壓、PLA2是發(fā)生血管代償性擴(kuò)張的獨(dú)立影響因素，見表3。

3 討論

心外膜下脂肪十分靠近心臟，可經(jīng)多種途徑對心臟及其組織造成不同程度的影響。國內(nèi)外有研究發(fā)現(xiàn)EATV與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化及冠狀動(dòng)脈狹窄和阻塞程度存在一定的相關(guān)性，并且提升了心血管事件的發(fā)生率[3]。EATV可通過炎癥因子產(chǎn)生作用，促進(jìn)冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜厚度增加，促進(jìn)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的產(chǎn)生和發(fā)展。在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者中，纖維斑塊的不穩(wěn)定會(huì)引起斑塊破裂、出血，最終導(dǎo)致心血管事件的發(fā)生[4-6]。目前有關(guān)EATV和炎癥因子與纖維斑塊穩(wěn)定性的相關(guān)性研究甚少。本文結(jié)果顯示，冠心病組的EATV、MMP-2、PLA2的水平均顯著高于瓣膜病組，且通過多因素Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)EATV、MMP-2、PLA2是血管代償性擴(kuò)張的獨(dú)立影響因素。血管代償性擴(kuò)張可影響血管內(nèi)壓力、血管上皮細(xì)胞生長因子及其他血管活性物質(zhì)的釋放，可加速上皮細(xì)胞增生、炎癥細(xì)胞沉積以及胞外基質(zhì)降解，是引起冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者血管狹窄的重要原因[7-8]。巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生MMP，當(dāng)血管發(fā)生代償性擴(kuò)張時(shí)可使上皮細(xì)胞增生及胞外基質(zhì)降解，大量的巨噬細(xì)胞聚集在一起，MMPs水平上升，繼而使血管上皮細(xì)胞生長因子增多，其中MMP-2可促進(jìn)胞外基質(zhì)降解，形成斑塊，使血管平滑肌增生，上皮細(xì)胞下新形成的血管極易進(jìn)入血管內(nèi)膜，破壞纖維斑塊的穩(wěn)定性[9-10]。另外，PLA2在血液中與LDL-C結(jié)合，使上皮細(xì)胞下氧化修飾低密度脂蛋白(OX-LDL)發(fā)生水解，產(chǎn)生游離的水解磷脂和脂肪酸，繼而損傷血管上皮細(xì)胞，引誘血液中單核細(xì)胞持續(xù)聚集于血管內(nèi)膜，生成大量的巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞又可吞噬OX-LDL形成泡沫細(xì)胞，泡沫細(xì)胞也能破壞纖維斑塊的穩(wěn)定性[11-12]。此外，PLA2還可促進(jìn)LDL-C與MMPs的結(jié)合，加速胞外基質(zhì)的降解，最終引發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化[13]。本文結(jié)果顯示，高血壓是血管代償性擴(kuò)張的獨(dú)立影響因素。高血壓對血管內(nèi)膜產(chǎn)生較大的壓力，加上機(jī)體內(nèi)各種神體液因子的作用，增加了纖維斑塊的不穩(wěn)定性，進(jìn)而出現(xiàn)斑塊破裂和出血以及血栓的形成，最終導(dǎo)致心肌缺血或心梗。雖然本文結(jié)果顯示MMP-2是血管代償性擴(kuò)張的獨(dú)立影響因素，然而并未進(jìn)行相關(guān)病理檢查，因此，未獲得相關(guān)結(jié)果，有待深入研究。

表2 血管代償性擴(kuò)張的單因素分析

表3 血管代償性擴(kuò)張的多因素 Logistic回歸分析

綜上所述，本文發(fā)現(xiàn)冠心病組心外膜脂肪中炎癥因子高于瓣膜病組，通過血管代償性擴(kuò)張的多因素Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)EATV、MMP-2、高血壓、PLA2是纖維斑塊穩(wěn)定性的獨(dú)立影響因素。對這些因素進(jìn)行有效控制，可減少心血管事件的發(fā)生。