何莉娜，趙中權，黃思藝，喬 蕾，俄廣鑫

（西南大學動物科技學院，重慶 400716）

山羊是最古老的被馴化的動物之一[1-3]，具有農業(yè)、經濟、文化甚至宗教作用，是重要的肉產品資源[4]。大足黑山羊原產于重慶市大足區(qū)，是當?shù)靥赜械娜庥煤谏窖蚱贩N，具有繁殖率高、肉質好、耐粗飼適應性強的特性[5]，2009 年列入國家級畜禽遺傳資源保護名錄[6]。

目前多種分子遺傳標記被廣泛應用于遺傳評估研究領域，如全基因組SNP[7-10]、線粒體DNA[11-14]、功能基因選擇[15-16]、微衛(wèi)星標記[17-22]等。尤其是，微衛(wèi)星標記的分布較廣、多態(tài)性豐富、呈共顯性遺傳以及檢測迅速方便等諸多優(yōu)點，故被廣泛用于群體遺傳多樣性研究。如Salamon 等[18]利用微衛(wèi)星標記技術評估了斑點豬有較高的遺傳多樣性。Bravo 等[19]利用微衛(wèi)星標記技術對克里奧爾羊和西班牙綿羊的遺傳多樣性進行了比較，證明了兩者遺傳距離很短。Hariyono 等[20]利用22 個微衛(wèi)星標記分析了8 個印尼當?shù)伉喨旱倪z傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關系。Azimu 等[21]利用20 個微衛(wèi)星標記分析南疆8 個地方雞種的遺傳多樣性及種群結構。Ee 等[22]采用20 個微衛(wèi)星標記分析了云南8 個本地山羊品種的遺傳多樣性，為云南本地山羊品種的保護和利用提供科學依據(jù)。綜上可見，微衛(wèi)星標記技術應用十分廣泛。本研究對重慶市大足區(qū)鐵山鎮(zhèn)大足黑山羊國家核心保種場內的大足黑山羊資源群體進行遺傳多樣性評估，為今后大足黑山羊品種改良提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 大足黑山羊來自大足區(qū)鐵山鎮(zhèn)大足黑山羊國家核心保種場。參考系譜信息，利用系統(tǒng)內隨機抽樣方法選擇55 個無親緣關系個體。用2%EDTA 抗凝管收集頸靜脈血2 mL，按照DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）的操作程序進行全基因組DNA提取。

1.2 微衛(wèi)星位點分析 本研究參照聯(lián)合國糧農組織（FAO）及國際遺傳學會（ISAG）推薦，共篩選出19個微衛(wèi)星位點，對55 個樣品進行遺傳多樣性分析。引物信息見表1。引物由武漢天一輝遠生物有限公司進行合成。

1.3 PCR 擴增與基因分型 PCR 擴增體系（15 μL）：Taq PCR Master Mix 7.5 μL，上、下 游 引 物 各0.5 μL（10 μmol/L），DNA 模 板0.5 μL（50～100 ng/μL），ddH2O 補至15 μL。

PCR 擴增程序：預變性94℃ 5 min；變性 94℃ 30 s，退火 30 s（具體退火溫度見表1），延伸 72℃ 30 s，30個循環(huán)；延伸72℃ 5 min；4℃保存。

PCR 擴增產物用ABI 3130 xl 全自動基因分析儀進行檢測，分析參數(shù)設置參照儀器使用說明書。Date collection V3.0 進行熒光信號數(shù)據(jù)收集。收集到的熒光數(shù)據(jù)用GnenMapper v3.7 進行基因型測定。

1.4 統(tǒng)計分析 觀測雜合度（Observed Heterozygosity，HO）、期望雜合度（Expected Heterozygosity，HE）、多態(tài)信息含量（Polymorphism Information Content，PIC）、等位基因數(shù)（Number of Alleles，NA）利用Microsatellite Toolkit 軟件包進行分析。群體近交系數(shù)（Fixation Indices of Subpopulation，F(xiàn)IS）利用Fstat 軟件包行分析。哈代溫伯格平衡（Hardy-Weinberg Epuilibrium，HWE）利用Genepop 軟件進行計算。群體瓶頸效應（Bottleneck Effect）利用Bottleneck 軟件進行分析。

表1 微衛(wèi)星位點信息

2 結果

2.1 微衛(wèi)星位點結果 從位點水平來看，19 個位點在該群體中共發(fā)現(xiàn)178 個NA，其中在SRCRSP8 位點最多，有18 個，SRCRSP15 位點最少，為5 個。就整體而言，SRCRSP8 有最高的HE和PIC，分別為0.909 5 和0.892 9；ILSTS029 的HE和PIC 最低，為0.363 0 和0.343 8。由表2 可以看出，有16 個微衛(wèi)星位點表現(xiàn)偏離哈代溫伯格平衡。

表2 19 個微衛(wèi)星位點遺傳多樣性分析結果

2.2 群體瓶頸效應檢測結果 在無限等位基因突變模型（Infinite Allele Mutation Model，IAM）、雙相突變模型（Two-Phase Mutation Model，TPM）和逐步突變模型（Step-Wise Mutation Model，SMM）假設下的Wilcoxon符號秩次檢驗的結果如表3 所示。大足黑山羊群體在SMM 模型下（P=0.000 06）經歷極顯著（P＜0.001）的瓶頸效應；在IAM 模型和TPM 模型下均未經歷瓶頸效應（P＞0.05）。Mode-shift 檢驗結果顯示正常即符合標準的L-型分布（表3）。

表3 大足黑山羊群體遺傳瓶頸檢測結果

2.3 群體遺傳多樣性結果 群體上來看，大足黑山羊群體的HE為0.694 2，HO為0.570 3，平均PIC為0.655 8，F(xiàn)IS為0.180，3 個位點處于哈代溫伯格平衡（表4）。

表4 群體遺傳多樣性分析結果

3 討 論

3.1 微衛(wèi)星位點分析 就單個位點來看，所選的19 個微衛(wèi)星位點中除了SRCRSP15、SRCRSP7、MAF209、ILSTS029和ILSTS005 位點為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），剩余位點PIC 均呈現(xiàn)高度多態(tài)性（PIC＞0.5）。整體結果表明該群體的遺傳多樣性豐富。根據(jù)哈代溫伯格平衡定律，在一個沒有選擇、突變、遺傳漂變以及隨機交配的大群體，基因頻率和基因型頻率是不會變的。該群體有16個位點表現(xiàn)偏離哈代溫伯格平衡，偏離個數(shù)較多。究其原因，大足黑山羊群體存在一定的人工選擇和近交，改變了群體的基因頻率，使得位點內等位基因偏離哈代溫伯格平衡。

3.2 群體瓶頸效應分析 本研究結果表明，大足黑山羊群體在SMM 模型下經歷了遺傳瓶頸，這一現(xiàn)象必須引起足夠重視，選育是有目的、有計劃、高強度的人工定向選擇。一方面，選育群體的經濟性狀（如生長、體型等）得到了顯著改良；另一方面，高強度的人工選擇可能引發(fā)強烈的遺傳瓶頸效應，增加近交衰退的可能性[23]，致使選育群體的生長性能、繁殖性能以及抗逆或抗病性能下降，這在許多動物（如牛[24-25]、豬[26]、靈長類動物[27]等）選育群體中曾經發(fā)生過。因此，在今后的育種工作中應該采取保留足夠的有效群體數(shù)量、擴大繁育親本數(shù)量，從而避免或降低瓶頸效應。

3.3 群體遺傳多樣性分析 群體上來看，大足黑山羊群體的HE為0.694 2，HO為0.570 3，雖然低于Dominguez 等[28]對墨西哥當?shù)厣窖虻难芯拷Y果。但是本研究結果高于大部分山羊群體遺傳多樣性的研究結果，包括長江沿岸中國山羊[12]、中國本地26 個山羊品種[29]以及中國克什米爾山羊[30]、意大利本土山羊[31]的研究結果。說明大足黑山羊群體的遺傳多樣性比較豐富。

PIC 是反映基因豐富度的一項指標，PIC 越高則表明群體遺傳基礎的多樣性越豐富。大足黑山羊群體的平均PIC為0.655 8，與巴巴里山羊的研究結果相當[32]，高于長江沿岸中國山羊品種[12]、26 個中國本地山羊品種[29]以及巴基斯坦山羊品種[33]的研究結果。說明大足黑山羊群體的基因豐富度較高，遺傳多樣性豐富。

本研究表明，大足黑山羊FIS為0.180，3 個位點處于哈代溫伯格平衡。群體近交程度越高，表示越偏離哈代溫伯格平衡。偏高于大部分山羊種群遺傳多樣性的研究結果，包括墨西哥Pastore?a 山羊[28]（FIS=0.032）、中國云嶺黑山羊[12]（FIS=0.160）、中國濟寧灰山羊[29]（FIS=0.124）等。由此可見，大足黑山羊群體內存在不同程度的近交。

4 結 論

本研究使用的19 個微衛(wèi)星位點具有高度多態(tài)性，可用作遺傳多樣性分析有效遺傳標記。多態(tài)性最好的位點為SRCRSP8，為0.892 9；多態(tài)性最低的為ILSTS029，為0.343 8。群體內HE高于HO，均大于0.5，表明該群體遺傳多樣性豐富。根據(jù)FIS和群體內偏離哈代溫伯格平衡位點數(shù)來看，建議該大足黑山羊國家核心保種場相關工作人員進一步加強保種工作，同時改變現(xiàn)有的保種模式和方案。