劉興余，劉德水，馬莉，馬雁軍， 楊振東，張杰，林琳，白若石*，周駿

1 上海煙草集團(tuán)北京卷煙廠有限公司技術(shù)中心, 北京市通州區(qū)萬盛南街99號，北京 101121；2 北京市煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測站，北京市通州區(qū)九棵樹西路196號，北京 101121

煙草特有N-亞硝胺（TSNAs，Tobacco Specific N-nitrosamines）是煙草特有的N-亞硝基類化合物，主要包括4 種致癌化合物：4 -（甲基亞硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK，4-(N-methyl-N-nitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone）、N-亞硝基去甲煙堿（NNN，N’-Nitrosonornicotine）、N-亞硝基新煙堿（NAT，N’-Nitrosoanatabine）、N-亞硝基假木賊堿（NAB，N’-Nitrosoanabasine）[1]。TSNAs 是卷煙煙氣和煙葉中同時(shí)存在的致癌物質(zhì)[2]。在煙草中TSNAs 的形成普遍認(rèn)為是由煙草中的生物堿和亞硝鹽反應(yīng)形成的[3-5]，由于晾曬煙中的TSNAs 含量明顯高于烤煙，使得絕大多數(shù)科學(xué)工作者集中在晾曬煙的研究上。

近幾十年來，如何降低晾曬煙煙草中的TSNAs的含量一直是煙草科研工作者研究的重點(diǎn)。目前已有多種方法可降低TSNAs的含量，如，在遺傳育種階段，可通過基因手段，培育低生物堿和低亞硝酸鹽的品種[6-8]；在種植階段，可改變栽培方式和施肥比例降低采后煙葉中TSNAs的生成量[9-10]；在煙葉采后調(diào)制階段，控制溫濕度和改變烘烤條件可抑制TSNAs的生成[4-5]；在貯藏階段，控制溫濕度可控制TSNAs的升高[11-13]；通過煙草加工過程中的輻照技術(shù)，可降低煙草及卷煙中TSNAs[14-15]。上述多種方法均可降低煙葉中TSNAs的含量，但有些方法存在一定的負(fù)面效應(yīng)，如，影響煙葉品質(zhì)和感官質(zhì)量等，真正實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的降TSNAs措施并不太多[16]。

已有研究證實(shí)煙葉貯藏過程是TSNAs 累積的重要階段[11,17-18]，貯藏過程中煙葉pH 值呈弱酸狀態(tài)（pH=5～6），適當(dāng)提高煙葉pH 值是否影響貯藏期間TSNAs 的累積未見報(bào)道。同時(shí)，pH 值是影響煙葉品質(zhì)的重要因素，因此需要考察貯藏過程中提高pH 值對煙葉品質(zhì)的影響?；跓熑~自身緩沖能力、緩沖液毒性及盡量減少煙草外源性化合物的添加以及考慮到燃燒性和吸食口感，本研究選擇碳酸鈉緩沖液作為調(diào)整煙葉pH 值的制劑，將打葉復(fù)烤過程作為施加環(huán)節(jié)，研究了碳酸鈉緩沖液對馬里蘭和白肋片煙貯藏過程中TSNAs 累積和煙葉品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

馬里蘭煙（C2，2016 年9 月采收）、白肋煙（C2F，2016 年9 月采收）、碳酸鈉（純度99.0%，天津渤化永利化工股份有限公司，天津，中國）、碳酸氫鈉（純度99.0%，天津渤化永利化工股份有限公司，天津，中國）。

ICS-3000 型離子色譜儀（ThermoFisher Scientific公司，馬薩諸塞州，美國）、在線固相萃取-高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（Spark Holland 公司，埃門，荷蘭）、AA3 型連續(xù)流動(dòng)分析儀（SEAL Analytical GmbH，德國）、pH 計(jì)（梅特勒-托利多公司，俄亥俄州，美國）、LR5091 型溫濕度記錄儀（HIOKI E.E.公司，長野，日本）。

1.2 方法

1.2.1 打葉復(fù)烤過程中添加碳酸鈉緩沖液

根據(jù)前期研究，選擇碳酸鈉緩沖液作為打葉復(fù)烤過程中調(diào)整煙葉pH 值的制劑。在復(fù)烤前的翻料裝置中，通過高壓噴霧將碳酸鈉緩沖液（Na2CO3∶NaHCO3=9 ∶1）按照煙葉干基重量的25%（體積/重量）均勻噴灑在片煙表面，實(shí)驗(yàn)設(shè)置碳酸鈉緩沖液0.75 mol/L 低濃度處理組和1.5 mol/L高濃度處理組。施加完碳酸鈉緩沖液的片煙進(jìn)入喂料柜，復(fù)烤至正常水分（12%），并裝箱（180 kg/箱）。煙箱平放且不碼垛，貯藏于北方某倉庫，進(jìn)行自然醇化，定期取樣。由于貯藏環(huán)境溫濕度會(huì)影響TSNAs的生成，故采用年/月/日表示貯藏時(shí)間。

1.2.2 煙葉貯藏期間溫濕度的采集

將溫濕度記錄儀放置于離煙箱上部1 m 位置，記錄煙葉貯藏期間的環(huán)境溫濕度變化。

1.2.3 煙葉中TSNAs 的測定

采用Zhang 等方法檢測貯藏期間片煙中TSNAs含量[19]。

1.2.4 煙葉中碳酸鈉-碳酸氫鈉的測定

對1.2.1 貯藏過程中采集的煙葉樣品，參考瑞士萬通儀器公司IC Application Note No. O-30 方法[20]，采用離子色譜法檢測煙葉中碳酸根和碳酸氫根的含量。

1.2.5 煙葉pH 值得測定

針對貯藏期間采集的樣品，按照YC/T 222—2007方法測定煙葉的pH 值。

1.2.6 煙葉的外觀質(zhì)量檢測

貯藏期的片煙外觀檢測，參考GB/T 8966—2005，從顏色、葉片結(jié)構(gòu)、葉面、光澤、顏色強(qiáng)度角度，對片煙的外觀質(zhì)量進(jìn)行檢測。

1.2.7 煙葉含水率檢測

針對貯藏期間采集的樣品，按照YC/T 31—1996方法測定煙葉貯藏期間的含水率。

1.2.8 煙葉常規(guī)化學(xué)成分的測定

18個(gè)月貯藏期間，對馬里蘭和白肋片煙進(jìn)行取樣，按照YC/T 468—2013 方法測定煙葉中的總植物堿含量，按照YC/T 162—2002 方法測定煙葉中的氯含量，按照YC/T 217—2007 方法測定煙葉中的鉀含量，按照YC/T 161—2002 方法測定煙葉中的總氮含量，按照YC/T 377—2017 方法測定煙葉中氨含量，按照YC/T 35—1996 方法測定煙葉中的總揮發(fā)堿含量，按照YC/T 159—2002 方法測定煙葉中的總糖含量。

1.2.9 煙葉感官質(zhì)量評價(jià)

針對貯藏18 個(gè)月的煙葉，參考YC/T 138—1998方法，從香型、香氣質(zhì)、香氣量、濃度、勁頭、雜氣、刺激性、余味和工業(yè)可用性方面評價(jià)煙葉的感官質(zhì)量。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS V17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，采用One-Way ANOVA對測定指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表明兩者差異顯著，P＜0.01表明兩者差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 煙葉貯藏期間溫濕度變化

對照組和處理組貯藏環(huán)境為可通風(fēng)自然倉儲(chǔ)環(huán)境，煙葉處于自然醇化狀態(tài)。溫濕度記錄了該倉庫2017 年4 月15 日至2018 年10 月31 日溫濕度數(shù)據(jù)。結(jié)果如圖1 所示，煙葉貯藏期間最低溫度-8.6℃，最高溫度為36.4℃，最低相對濕度為21.8%，最高相對濕度為82.8%。

2.2 碳酸鈉緩沖液對貯藏期間煙葉中TSNAs 累積的影響

貯藏期間馬里蘭煙葉中TSNAs 含量變化趨勢如圖2 所示，經(jīng)過18 個(gè)月的貯藏，對照組煙葉中總TSNAs 含量增加了310.6%（7579.0 μg →31121.1 μg）；低濃度處理組煙葉中總TSNAs 含量增加了181.5%（8156.3 μg →22962.1 μg）； 高 濃 度 處理組煙葉中總TSNAs 含量增加了140.8%（7698.9 μg →18540.1 μg），且該處理組煙葉中TSNAs 含量比對照組低40.4%。貯藏期間白肋煙葉中TSNAs 含量變化趨勢如圖3 所示，經(jīng)過18 個(gè)月的貯藏，對照組煙葉中總TSNAs 含量增加了289.3%（6097.7 μg →23740.0 μg）；低濃度處理組煙葉中總TSNAs含 量 增 加 了224.7%（5962.0 μg →19362.0 μg）；高濃度處理組煙葉中總TSNAs 含量增加了149.5%（6075.7 μg →15158.7 μg），且 該 處 理 組 煙 葉 中TSNAs 含量比對照組低36.2%。

圖1 貯藏期間環(huán)境溫濕度變化Fig. 1 The variation of environmental temperature and humidity during storage

圖2 貯藏期間馬里蘭煙葉中TSNAs 的變化（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n=5）Fig. 2 The variation of the TSNAs level of Maryland tobacco leaves during storage (Mean±S.D., n=5)

經(jīng)One-Way ANOVA分析處理組與對照組的差異，在所有的貯藏時(shí)間點(diǎn)，高濃度處理組的兩種煙葉中NNN、NAT、NNK、NAB 和總TSNAs 含量均顯著低于對照組（P ＜0.01）。對低濃度處理組的兩種煙葉而言，所有貯藏時(shí)間點(diǎn)的NNN、NAT 和總TSNAs含量均顯著低于對照組（P ＜0.01）。在整個(gè)貯藏過程中，煙葉中TSNAs 累積量的高低順序?yàn)椋焊邼舛忍幚斫M＜低濃度處理組＜對照組，說明碳酸鈉緩沖液具有減少煙葉貯藏過程中TSNAs 累積的作用。另外，夏天氣溫較高時(shí)，TSNAs 生成速率較大，冬季氣溫較低時(shí)，TSNAs 生成速率較小。

圖3 貯藏期間白肋煙葉中TSNAs 的變化（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n=5）Fig. 3 The variation of the TSNAs level of Burley tobacco leaves during storage (Mean±S.D.，n=5)

2.3 貯藏期間煙葉中 和含量

表1 貯藏期間馬里蘭和白肋煙葉中 和的含量Tab. 1 The contents of and of Maryland and Burley tobacco leaves during storage μg/g

表1 貯藏期間馬里蘭和白肋煙葉中 和的含量Tab. 1 The contents of and of Maryland and Burley tobacco leaves during storage μg/g

2.4 碳酸鈉緩沖液對貯藏期間煙葉pH 值的影響

圖4 貯藏期間馬里蘭煙葉pH 值的變化（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n=5）Fig. 4 The variation of the pH value of Maryland tobacco leaves during storage (Mean±S.D.，n=5）

考慮煙葉打葉復(fù)烤過程中水分限制、施加均勻性，以及避免煙葉卷曲及損耗，中試工藝試驗(yàn)選擇復(fù)烤前匯集皮運(yùn)帶的翻料裝置。貯藏貯藏過程中煙葉pH 值變化情況如圖4 和圖5 所示。結(jié)果顯示，18個(gè)月的貯藏期間，馬里蘭煙對照組pH 值由5.30 降至5.19，白肋對照組pH 值由5.50 降至5.26，馬里蘭煙低劑量處理組pH 值由6.35 降至5.94，白肋低劑量處理組pH 值由6.70 降至5.96，馬里蘭煙高劑量處理組pH 值由7.08 降至6.34，白肋高劑量處理組pH 值由7.61 降至6.83。由結(jié)果可以看出，高劑量處理組能夠較好地保持煙葉處于中性狀態(tài)。另外，由于在貯藏前期煙葉內(nèi)部化學(xué)反應(yīng)劇烈，導(dǎo)致處理組煙葉的pH 值下降較快，但貯藏至3 個(gè)月后（貯藏中后期），pH 值保持穩(wěn)定。同時(shí)，在pH 快速下降期內(nèi)（貯藏前期），煙葉中TSNAs 生成速率也高于貯藏的中后期。

2.5 碳酸鈉緩沖液對煙葉外觀的影響

對照組和碳酸鈉處理組的煙葉經(jīng)18個(gè)月貯藏后，煙葉外觀如圖6 和圖7 所示，與對照組比較，處理組煙葉的顏色、光澤和顏色強(qiáng)度無明顯區(qū)別，也沒有出現(xiàn)變暗或變黑。

圖5 貯藏期間白肋煙葉pH 值的變化（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n=5）Fig. 5 The variation of the pH value of Burley tobacco leaves during storage (Mean±S.D.，n=5）

圖6 貯藏18 個(gè)月后的馬里蘭片煙Fig. 6 The appearance of Maryland tobacco leaves after storing for 18 months

圖7 貯藏18 個(gè)月后的白肋片煙Fig. 7 The appearance of Burley tobacco leaves after storing for 18 months

圖8 貯藏過程中馬里蘭煙和白肋煙煙葉中水分含量（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n=5）Fig. 8 The moisture content of Maryland and Burley tobacco leaves during storage (Mean±S.D.，n=5）

2.6 貯藏過程中煙葉中水分含量的變化

如圖8 所示，馬里蘭和白肋煙葉在18 個(gè)月的貯藏過程中，對照組煙葉水分含量范圍為6.35%～19.64%，低濃度處理組煙葉中水分含量范圍為7.12%～22.02%，高濃度處理組煙葉中水分含量范圍為6.85%～22.80%，處理組煙葉中含量高于對照組，上述煙葉水分含量隨著倉庫環(huán)境濕度的變化而變化，但均處于可接受的范圍。

2.7 碳酸鈉緩沖液對貯藏期間煙葉常規(guī)化學(xué)成分的影響

18 個(gè)月的貯藏時(shí)間，對照組和處理組煙葉中總植物堿、氯、鉀、總氮、氨、總揮發(fā)堿和總糖的變化如圖9 和圖10 所示。對照組和處理組煙葉中總植物堿含量均呈緩慢下降趨勢，其中，馬里蘭對照組煙葉中總植物堿含量由2.28%下降至2.01%，馬里蘭低濃度處理組煙葉中總植物堿含量由2.22%下降至1.79%，馬里蘭高濃度處理組煙葉中總植物堿含量由2.24%下降至1.73%。

如圖9 和圖10 所示，對照組和處理組煙葉中氯含量、鉀含量和總氮含量在18 個(gè)月的貯藏期內(nèi)保持穩(wěn)定，而煙葉中氨含量、總揮發(fā)堿含量和總糖含量呈明顯下降趨勢。其中，馬里蘭對照組煙葉中氨含量、總揮發(fā)堿含量和總糖含量分別由0.29%、0.51% 和3.13% 下 降 至0.22%、0.40% 和1.70%，馬里蘭高濃度處理組氨含量、總揮發(fā)堿含量和總糖含量分別由0.21%、0.42% 和3.22% 下降至0.16%、0.34%和1.35%。白肋對照組煙葉中氨含量、總揮發(fā)堿含量和總糖含量分別由0.28%、0.87%和0.88% 下降至0.22%、0.73% 和0.43%，白肋高濃度處理組煙葉中氨含量、總揮發(fā)堿含量和總糖含量分別由0.21%、0.69% 和0.87% 下降至0.18%、0.62%和0.34%。

2.8 碳酸鈉緩沖液對煙葉感官質(zhì)量的影響

如表2 所示，馬里蘭和白肋煙葉處理組感官質(zhì)量總得分略高于對照組，特別是在雜氣和刺激性方面，兩種煙葉的處理組得分值明顯高于對照組，其它感官指標(biāo)處理組與對照組煙葉差別不大，說明碳酸鈉緩沖液處理后的煙葉，經(jīng)過18 個(gè)月的貯藏后，雜氣和刺激性明顯下降。

圖9 貯藏期間馬里蘭煙葉中總植物堿、氯、鉀、總氮、氨、總揮發(fā)堿和總糖的含量變化（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n=5）Fig. 9 The variation of total plant alkali, chlorine, potassium, total nitrogen, ammonia, total volatile alkali and total sugar in Maryland tobacco leaves during storage (Mean±S.D.，n=5）

圖10 貯藏期間白肋煙葉中總植物堿、氯、鉀、總氮、氨、總揮發(fā)堿和總糖的含量變化（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n=5）Fig. 10 The variation of total plant alkali, chlorine, potassium, total nitrogen, ammonia, total volatile alkali and total sugar in Burley tobacco leaves during storage (Mean±S.D.，n=5）

表2 碳酸鈉緩沖液處理組和對照組煙葉感官質(zhì)量評價(jià)結(jié)果Tab. 2 Sensory quality evaluation results of sodium carbonate buffer treatment group and control group

3 討論

多年來，如何降低晾曬煙中的TSNAs 的含量一直是煙草科研工作者研究的重點(diǎn)。從TSNAs 的生成機(jī)理可以看出[2]，煙堿及其衍生物是導(dǎo)致TSNAs 生成的前體物，煙堿類物質(zhì)存在于煙草中，TSNAs 便難以完全除掉，這也導(dǎo)致降低甚至完全剔除煙草中TSNAs 成為煙草行業(yè)的難題。

研究人員從育種、栽培、采收、調(diào)制、貯藏和加工等不同環(huán)節(jié)，對降低煙葉中TSNAs 進(jìn)行了研究，獲得了多種降低TSNAs 的方法。在遺傳育種階段，可通過基因手段，培育低生物堿和低特有亞硝酸鹽的品種，可大幅度降低煙葉中TSNAs 含量（NNN 下降70%以上）[8]，但有些基因技術(shù)的植物代際間變異和遺傳性需要進(jìn)一步的驗(yàn)證[6-8]；在煙葉采后調(diào)制階段，控制溫濕度和改變烘烤條件可抑制TSNAs 的生成，可抑制TSNAs 累積達(dá)40%以上，但該措施需要特定的調(diào)制場所[4-5]；在醇化階段，控制溫濕度可抑制TSNAs 的升高[21]，但存在一定的成本問題；貯藏階段施加抗氧化劑可降低TSNAs 的累積達(dá)20%[22]，但抗氧化劑存在自然氧化和影響口感問題；另有研究通過輻照技術(shù)降低煙草及卷煙中TSNAs[14-15]，但由于輻照源的使用限制和對煙草品質(zhì)的不利影響，大大降低了輻照技術(shù)的工業(yè)應(yīng)用效果。

貯藏期的煙葉pH 值為5～6，同時(shí)煙葉中含有亞硝酸鹽和生物堿，大多數(shù)研究均證實(shí)貯藏期間煙葉中TSNAs 隨著貯藏期的增加而逐漸升高[11-13]。文章研究結(jié)果也表明提高煙葉pH 值可減少貯藏期間TSNAs 的累積。因此，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)室研究，篩選出了提高煙葉pH 值的良好制劑（碳酸鈉緩沖鹽），在生產(chǎn)工藝允許條件下，最高施加體積設(shè)為煙葉干基重量的25%。另外，堿性過高會(huì)燒傷煙葉。1.5 mol/L 的碳酸鈉緩沖液可使打葉復(fù)烤后的煙葉pH 值呈弱堿性狀態(tài)（pH=7～8），故選擇該濃度作為碳酸鈉緩沖液的上限濃度。由于煙葉貯藏階段TSNAs 逐漸升高，且前期升高較快，因此，選擇打葉復(fù)烤環(huán)節(jié)進(jìn)行碳酸鈉緩沖液的施加，從而抑制貯藏階段的TSNAs 累積。同時(shí)考慮到貯藏前期處理組pH 值下降較快，應(yīng)在煙葉調(diào)制后盡快進(jìn)行打葉復(fù)烤，縮短打葉復(fù)烤前的貯藏時(shí)間，從而抑制TSNAs 的快速生成。由于碳酸鈉成本低廉，打葉復(fù)烤施加過程工藝簡單，且抑制TSNAs 效果顯著，因此，具有較好的工業(yè)應(yīng)用性。

針對碳酸鈉緩沖液處理過的煙葉，測定了煙葉外觀、水分、煙葉化學(xué)成分和感官質(zhì)量，進(jìn)而評價(jià)碳酸鈉緩沖液對煙葉品質(zhì)的影響。經(jīng)過碳酸鈉緩沖液處理過的煙葉的顏色、光澤和顏色強(qiáng)度沒有變化，也沒有出現(xiàn)變暗或黑色，說明碳酸鈉緩沖鹽對煙葉的外觀特征沒有影響。在自然貯藏期間，同一倉庫中的處理組煙葉水分高于對照組。這對貯藏于干燥環(huán)境的煙葉而言，有利于降低煙葉造碎，提高醇化質(zhì)量。

貯藏開始時(shí)，處理組煙葉中的氨和總揮發(fā)堿含量低于處理組，這可能與碳酸鈉緩沖液導(dǎo)致煙葉中氨和總揮發(fā)堿快速釋放有關(guān)。隨著貯藏時(shí)間的延長，氨和總揮發(fā)堿趨于穩(wěn)定，且兩種煙葉中氨含量、總揮發(fā)堿含量和總糖含量均呈現(xiàn)出高濃度處理組＜低濃度處理組＜對照組。研究證實(shí)，煙葉中氨和總揮發(fā)堿過多不利于感官質(zhì)量，特別是總揮發(fā)堿含量與煙氣刺激性呈顯著正相關(guān)，煙葉中總揮發(fā)堿含量較低可以提高煙葉吸食的舒適性[23]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)經(jīng)碳酸鈉緩沖液處理過的煙葉，貯藏后的煙葉中氨含量和總揮發(fā)堿含量均低于對照組，這有利于降低吸食的刺激性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)經(jīng)碳酸鈉緩沖液處理過的煙葉，貯藏后的煙葉中氨含量和總揮發(fā)堿含量均低于對照組，這有利于降低吸食的刺激性，這與感官評價(jià)結(jié)果較為一致。另外，由于晾曬煙中含糖量較低，在后期加工過程中需要添加大量的糖類，因此，總糖含量不作為碳酸鹽影響晾曬煙葉品質(zhì)的評判指標(biāo)。

4 結(jié)論

在馬里蘭和白肋煙葉貯藏過程中，碳酸鈉緩沖液具有調(diào)節(jié)煙葉pH 值的作用，碳酸鈉緩沖液處理組煙葉中TSNAs 含量低于對照組，且施加25%（體積/煙葉干基重）1.5 mol/L 的碳酸鈉緩沖液，具有顯著抑制TSNAs 累積的效果。碳酸鈉緩沖液處理過的煙葉外觀與對照組無差異，煙葉含水率高于對照組，煙葉中總植物堿和總糖含量低于對照組，煙葉中氨、總揮發(fā)堿低于對照組，處理組煙葉感官質(zhì)量評價(jià)總得分高于對照組，實(shí)驗(yàn)中采用的碳酸鈉緩沖液對貯藏期間的煙葉品質(zhì)未顯示負(fù)面作用。