陳 雅, 袁德義, 李艷民, 張 健, 胡觀興, 鄒 鋒

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004)

油茶屬山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)植物，為我國特有的木本食用油料樹種，與油橄欖、油棕、椰子并稱為世界4大木本油料植物，被譽(yù)為“東方的橄欖樹”[1-2].高產(chǎn)和抗病性強(qiáng)是油茶育種著重實(shí)現(xiàn)的目標(biāo).攸縣油茶(C.yuhsienensisHu)，又稱薄殼香油茶，具有抗炭疽病強(qiáng)、油質(zhì)好等優(yōu)良性狀[3].普通油茶‘華碩’(C.oleifera‘Huashuo’)由中南林業(yè)科技大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)培育出的大果高產(chǎn)新品種[4].本課題組探究發(fā)現(xiàn)，以普通油茶‘華碩’為母本，攸縣油茶為父本，存在遠(yuǎn)緣雜交障礙生殖隔離的現(xiàn)象，而反交具備雜交親和性，這為綜合利用親本的優(yōu)良性狀來創(chuàng)新種質(zhì)和遺傳改良創(chuàng)造了條件.在通過雜交導(dǎo)入近緣種屬植物優(yōu)異基因的同時(shí)，許多不良性狀也將不可避免地被帶入到栽培品種中[5].為獲得綜合性狀優(yōu)良的新種質(zhì)或品種，還需對遠(yuǎn)緣雜種后代進(jìn)行多代回交或與其他栽培品種進(jìn)行雜交等，了解雜交F1代的開花和繁育系統(tǒng)是高效利用優(yōu)異基因的關(guān)鍵[6].為此，本研究以攸縣油茶為母本，普通油茶‘華碩’為父本的遠(yuǎn)緣雜交F1代為材料，對其花部特征、花粉特性和授粉特性等開花、繁育系統(tǒng)進(jìn)行了研究，旨在為高效利用親本優(yōu)異資源并進(jìn)一步拓寬油茶種質(zhì)資源提供指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 材料

2012年11月中下旬，正值油茶盛花期，采集普通油茶‘華碩’的花粉貯藏備用.2013年3月，選擇母本攸縣油茶發(fā)育良好的花蕾，上午去除待授粉花苞中的全部雄蕊后，進(jìn)行人工授粉、套袋、標(biāo)記，7 d左右后拆袋；當(dāng)年10月下旬果實(shí)成熟，收獲150余粒雜交種子.2014年3月，播種雜交種子并育苗，單株標(biāo)號后隨機(jī)定植在苗圃地中.2018年初選獲得攸縣油茶(P1)×普通油茶‘華碩’(P2)種間雜交F1代優(yōu)良單株，共18株，單株以YH-1、YH-2……YH-18表示.雜交F1代株行距為3 m×4 m，統(tǒng)一進(jìn)行常規(guī)水肥管理.

1.2 花部綜合特征的觀察

1.2.1 花器性狀的測量 盛花期隨機(jī)選取10朵花，采用游標(biāo)卡尺測量花徑、雌蕊群高度、花柱高度和雄蕊群高度等；目測并記錄花瓣數(shù)、心室數(shù)/花柱數(shù)和花藥數(shù)量；在體視顯微鏡下用鑷子解剖子房，統(tǒng)計(jì)每個(gè)子房中胚珠的數(shù)量.

1.2.2 花部顯微結(jié)構(gòu)的觀察 對花藥和子房進(jìn)行解剖，具體參照Iqbal et al[7]和Liao et al[8]的方法并稍作更改；用掃描電鏡觀察花粉的微觀形態(tài)，具體參考李春林等[9]的方法.

1.3 雜交F1代繁育系統(tǒng)類型的確定

1.3.1 花粉數(shù)量的確定 具體參考袁德義等[10]的方法.采集約20朵待放的花蕾，用鑷子將花藥取出置2.5 mL離心管中(每朵花10枚花藥)，用1%纖維素酶懸浮液裂解花藥壁，處理24 h，充分振蕩，花粉均勻分散在酶解液中.取5 μL溶液滴于載玻片上，顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)花粉粒和“擬花粉”的數(shù)量，重復(fù)3次.單枚花藥的花粉量=(載玻片上的總花粉粒數(shù)×200)/10.

1.3.2 花粉胚珠比及繁育系統(tǒng)類型的確定 綜合花粉數(shù)量和胚珠數(shù)的測定結(jié)果，計(jì)算花粉胚珠比，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.依據(jù)Cruden[11]的標(biāo)準(zhǔn)，確定繁育系統(tǒng)的類型.

1.3.3 雜交指數(shù)的確定 依據(jù)Dafni[12]的標(biāo)準(zhǔn)對花朵進(jìn)行測量并對開花行為進(jìn)行觀測，采用雜交指數(shù)對其繁育系統(tǒng)進(jìn)行評判.其中，采用聯(lián)苯胺—過氧化氫法[13]測定柱頭可授性，以確定雌雄蕊成熟時(shí)間的先后，確定花藥未散粉前，雌蕊(柱頭)是否具有可授性.具體方法：在油茶小蕾期和大蕾期花藥未散粉時(shí)，去除花萼和苞片，將柱頭浸入含有聯(lián)苯胺—過氧化氫反應(yīng)液(1%聯(lián)苯胺∶3%過氧化氫∶水的體積比為4∶11∶22)中，若柱頭周圍的反應(yīng)液呈藍(lán)色并有氣泡出現(xiàn)，則表明其具有可授性，氣泡的多少可看出柱頭可授性的強(qiáng)弱.

1.3.4 花粉活力的測定 為確保人工授粉試驗(yàn)成功，授粉前須測定所需花粉的活力.具體有兩種方法：(1)瓊脂培養(yǎng)法[14]：采集盛花期的花蕾，待花粉陰干后立即播種于0.1%硼酸+10%蔗糖+1%瓊脂的培養(yǎng)基上，于25 ℃培養(yǎng)4 h，統(tǒng)計(jì)花粉活力.花粉活力/%=已萌發(fā)的花粉數(shù)/花粉總數(shù)×100.(2)亞歷山大染色法[15]：用亞歷山大染液對花粉和“擬花粉”進(jìn)行染色.

1.3.5 人工授粉試驗(yàn)及坐果率調(diào)查 人工授粉田間試驗(yàn)于2018年12月進(jìn)行，分別以攸縣油茶×普通油茶‘華碩’18個(gè)雜交F1代為母本，設(shè)計(jì)以下授粉處理.(1)異花授粉：大蕾期花朵去雄，用普通油茶‘華碩’的花粉授粉后套袋；(2)自花授粉：大蕾期花朵去雄，用本樹的花粉授粉后套袋；(3)去雄不授粉：大蕾期花朵去凈雄蕊后套袋；(4)自然授粉：對花蕾不做特殊處理.授粉后7 d左右拆袋.當(dāng)果實(shí)膨大后計(jì)算坐果率.

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 19.0軟件對各雜交F1代的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行顯著性差異分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 花部特征

油茶雜交F1代7個(gè)花器的性狀均介于雙親之間，未出現(xiàn)超親現(xiàn)象(表1).從圖1A和表1可見：雜交F1代的花頂生，近于無花梗，花瓣數(shù)為6～9，變異系數(shù)為12.85%；花冠白色，呈輻射狀，倒卵形，先端凹入，基部狹窄，花徑87.86 mm，變異系數(shù)為13.73%；雄蕊群高度為16.81 mm，變異系數(shù)為18.50%；雄蕊數(shù)為60～107，變異系數(shù)為21.35%.從圖1B、1E和1F可見，花藥黃色，著生于花絲上，呈蝴蝶型，花藥囊中存在黃色花粉粒和“擬花粉”.其中，黃色花粉粒呈腦紋狀或桔皮狀，有不規(guī)則分布的脊?fàn)钔黄鸬燃y飾特征(圖1I)，為二細(xì)胞花粉；而“擬花粉”為白色，有明顯的肋狀條紋特征(圖1I)，主要集中于花藥囊中，且這個(gè)位置也是藥隔消失的位置.解剖后發(fā)現(xiàn)，“擬花粉”是由藥隔組織遷移到花藥囊中，使得花藥囊中充滿兩種不同顏色的花粉.雜交F1代雌蕊為復(fù)雌蕊，花柱數(shù)與心皮數(shù)相同，為3～5，變異系數(shù)為19.31%；雌蕊群高度為10.84 mm，變異系數(shù)為21.68%.

表1 油茶親本及雜交F1代花部的綜合特征1)

1)同列數(shù)據(jù)后附不同字母者表示差異顯著(P<0.05)，附相同字母者表示差異不顯著(P>0.05).

梁月榮等[16]對茶樹花器顯微結(jié)構(gòu)的觀察顯示，柱頭的結(jié)構(gòu)與花柱明顯不同.花柱表面光滑，而柱頭表面密布乳突細(xì)胞，呈狹長條狀，排列緊密，其展開最大面積接收盡可能多的花粉粒.花粉管在乳突細(xì)胞的間隙中生長(圖1C、1G)；雜交F1代為上位子房，中軸胎座，胚珠著生在中軸上，倒生胚珠有外珠被和內(nèi)珠被的雙珠被結(jié)構(gòu)，其內(nèi)為胚囊結(jié)構(gòu)(圖1A、1D、1H)，雜交F1代的胚珠數(shù)為15.75～24.67，變異系數(shù)為19.95%.

2.2 油茶雜交F1代花粉數(shù)量及活力

2.2.1 花粉胚珠比 花部綜合特征顯微觀察顯示，油茶雜交F1代的花藥中存在“擬花粉”，因此對雜交F1代進(jìn)行花粉數(shù)量及花粉胚珠比的測定是建立在剔除“擬花粉”的干擾下進(jìn)行的.對雜交F1代花粉數(shù)量觀察的結(jié)果(表2)顯示，雙親中黃色花粉粒與白色花粉粒的比值分別為3∶1和2∶1，雜交F1代主要為3∶1，還存在1∶2、2∶1、4∶1和5∶1的情況.雜交F1代單個(gè)花藥“擬花粉”的數(shù)量為1 351.4～2 531.4，單個(gè)花藥黃色花粉的數(shù)量為880.0～10 857.2.其中，YH-2的花粉數(shù)量為880.0，顯著低于其他雜交F1代的花粉數(shù)量；YH-12和YH-14的花粉數(shù)量顯著高于其他雜交F1代的花粉數(shù)量.油茶雜交F1代花粉胚珠比為3 813.33～59 410.49，平均值為24 201.85，依據(jù)Cruden[11]的標(biāo)準(zhǔn)，分析發(fā)現(xiàn)雜交F1代的繁育系統(tǒng)均為專性異交型.

表2 油茶雜交F1代的花粉數(shù)量及活力1)

1)同列數(shù)據(jù)后附不同字母者表示差異顯著(P<0.05)，附相同字母者表示差異不顯著(P>0.05).

2.2.2 花粉活力 對油茶雜交F1代花粉活力進(jìn)行檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)“擬花粉”的存在，其不具有活力，具體表現(xiàn)為：亞歷山大染色法中的“擬花粉”不能被染成代表花粉具有活力的紅色，也不能染成不具有花粉育性的綠色(圖2A)，瓊脂培養(yǎng)法中的“擬花粉”不能萌發(fā)出花粉管(圖2B)，均說明“擬花粉”不具備作為雄配子體的功能；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)亞歷山大染色法不適宜作為油茶花粉活力檢測的方法，因染色法能使花粉全部染成紅色不能準(zhǔn)確反映花粉的活力，該方法也不能作為油茶花粉活力的快速測定方法.

因此，本研究采用瓊脂培養(yǎng)法對油茶雜交F1代進(jìn)行花粉活力的檢測，結(jié)果(表2)顯示，雜交F1代的花粉活力為10.82%～71.69%，表明雜交F1代的花粉均具有活力，可用于人工授粉.其中，YH-2、YH-11、YH-12和YH-13的花粉活力低于20%，顯著低于親本及其他雜交F1代，而YH-5的花粉活力顯著高于親本及其他雜交F1代，花粉活力為71.69%.

2.3 人工授粉試驗(yàn)結(jié)果

表3 油茶F1代人工授粉下的坐果率

等坐果穩(wěn)定后統(tǒng)計(jì)結(jié)實(shí)率，未成功授粉的子房變黃進(jìn)而萎蔫凋謝，授粉成功的花朵則花冠開始凋萎，子房膨大.不同授粉方式下油茶雜交F1代的坐果率不同，不同雜交F1代的坐果率也存在一定差異，而雜交F1代均呈現(xiàn)出相同規(guī)律.坐果率大小表現(xiàn)為：異花授粉>自然授粉>自花授粉>去雄不授粉(0)(表3).

去雄不進(jìn)行任何授粉處理套袋后沒有成功坐果，表明油茶雜交F1代不存在無融合生殖現(xiàn)象；雜交F1代的自交坐果率有明顯差異，存在明顯的分離現(xiàn)象.其中，YH-4、YH-6、YH-7、YH-1、YH-9和YH-3自花授粉的坐果率大于0，且YH-4和YH-6有較高的坐果率，其余都不能自花授粉成功受精，無法坐果.采用普通油茶‘華碩’作為回交親本，說明異交授粉的坐果率高于自交，還說明回交結(jié)實(shí)率較高，遠(yuǎn)緣雜交障礙不明顯.

綜上，由人工授粉試驗(yàn)結(jié)果可推斷出油茶雜交F1代的繁育系統(tǒng)以異交為主，部分雜交F1代自交親和.

3 討論

花朵作為被子植物的生殖器官,其特征對傳粉及交配產(chǎn)生一定的影響[17].前人研究表明，油茶花部結(jié)構(gòu)上有典型的蟲媒花特征[17].本文從以下幾個(gè)方面闡述油茶雜交F1代花部的綜合特征：花大，花徑87.86 mm，變異系數(shù)為13.73%，按照Abe[18]的劃分標(biāo)準(zhǔn)，花徑超過27.86 mm屬于大型花，能夠吸引訪花昆蟲，增加傳粉機(jī)會[19]；柱頭與花藥之間存在空間隔離；柱頭表面密布乳突細(xì)胞，呈狹長條狀，排列緊密，其展開最大面積接收盡可能多的花粉粒；花藥和花粉呈鮮艷的黃色，能達(dá)到吸引昆蟲的效果；花粉富含營養(yǎng)，可補(bǔ)償傳粉昆蟲訪花時(shí)付出的能量消耗[20]；花藥囊中存在“擬花粉”，其大小與花粉粒基本一致，有肋狀紋飾特征，呈白色球狀體，不具有花粉活力.運(yùn)用石蠟切片技術(shù)觀察到“擬花粉”起源于藥隔組織的薄壁細(xì)胞，分化并遷移至小孢子囊中，與前人對山茶科的富蘭克林樹(Frankliniaalatamaha)[21]、港口木荷(Schimasuperbavar.kankoensis)[21]和茶樹[C.sinensis(L.) Kuntze][22]的研究結(jié)果一致.推測可能是油茶作為一種蟲媒花，運(yùn)用適用性繁殖策略，以一種欺騙方式滿足吞食昆蟲對食物供應(yīng)的巨大需求[23-24]；也可能是一種確保受精的繁殖策略，運(yùn)用“擬花粉”稀釋某種花粉，以提高授粉受精的競爭力[8].對油茶雜交F1代花部綜合特征的觀察表明，其花部特征可能對自花授粉存在阻礙，同時(shí)又具備吸引傳粉媒介的適應(yīng)性.

對油茶雜交F1代花部綜合特征進(jìn)行分析的結(jié)果表明，其花部特征有蟲媒花的結(jié)構(gòu)特征，具有異交的可能性，而后對其繁育系統(tǒng)的研究可以驗(yàn)證這種可能性.按照Dafni[12]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行雜交指數(shù)測定，雜交F1代的雜交指數(shù)為4，表明種間雜交F1代的繁育系統(tǒng)為專性異交型；雜交F1代花粉的胚珠比為24 201.85，依據(jù)Cruden[11]以花粉胚珠比評判繁育系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)，其繁育系統(tǒng)屬于專性異交型；不同授粉方式下套袋試驗(yàn)結(jié)果顯示，異花授粉的坐果率最高.可見，由雜交指數(shù)、花粉胚珠比和人工授粉試驗(yàn)3種方法檢測到的油茶種間雜交F1代的繁育系統(tǒng)基本一致，屬于專性異交的交配系統(tǒng)，這與前人[25-27]的“油茶的繁育系統(tǒng)為專性異交型”研究結(jié)果一致.但在本研究中，YH-4和YH-7等自花授粉后有較高的坐果率，表現(xiàn)出油茶的偽自交不親和性，這可能與某些基因型中的自交不親和性狀減弱有關(guān)，這些在一定程度上證明油茶會出現(xiàn)自交不親和性狀的可變表達(dá)現(xiàn)象[28]，也有可能與自交不親和性在后代中發(fā)生分離有關(guān).這一條件為油茶育種提供了選擇穩(wěn)定和優(yōu)良自交系的機(jī)會；而從另一個(gè)角度來說，油茶雜交F1代的異花授粉明顯優(yōu)于自然授粉.這說明由于油茶在自然狀態(tài)下坐果率低，在生產(chǎn)栽培中，人工輔助授粉及授粉樹的配置顯得尤為重要；同時(shí)也說明遠(yuǎn)緣雜交F1代回交結(jié)實(shí)率很高，遠(yuǎn)緣雜交障礙不明顯，可能由親本復(fù)雜的基因型決定，其具體原因有待進(jìn)一步探討.由于試驗(yàn)限制，本研究僅僅采用普通油茶‘華碩’作為回交父本，未來試驗(yàn)將探討攸縣油茶作為回交父本對授粉受精的影響.

植物的傳粉系統(tǒng)由花粉、柱頭和傳粉媒介3部分組成[29]，花粉數(shù)量多少、花粉活力和柱頭可授性的高低直接影響授粉受精，有些甚至?xí)绊懽鸞30].本研究中花粉數(shù)量的多少、花粉活力、柱頭可授性的高低與自交結(jié)實(shí)率無明顯相關(guān)性，可能源于其他因素，與柱頭識別有關(guān).油茶雜交F1代的花粉數(shù)量與花粉活力存在顯著差異.本研究中，YH-12和YH-14的花粉數(shù)量最多，YH-2最少，這說明植株單個(gè)花藥中花粉數(shù)量的多少與品種自身的遺傳特性、樹體營養(yǎng)、花芽發(fā)育狀況及氣候條件、栽培管理措施等有關(guān)，但與自身遺傳特性的關(guān)系最為密切[31].研究顯示，亞歷山大染色法不適宜快速測定油茶的花粉活力.瓊脂培養(yǎng)法檢測結(jié)果顯示，油茶雜交F1代的花粉活力為10.82%～71.69%，表明花粉活力存在顯著差異，出現(xiàn)廣泛的分離現(xiàn)象.YH-2、YH-11、YH-12和YH-13的花粉活力普遍較低，低于20%，相較于親本來說，這些為超低親個(gè)體.從另一個(gè)角度來看，若利用油茶雜交F1代的低育性植株來進(jìn)行連續(xù)的回交和人工選擇，極有可能培養(yǎng)出穩(wěn)定的不育植株.

4 結(jié)論

根據(jù)花部綜合特征、花粉胚珠比、雜交指數(shù)及人工授粉(普通油茶‘華碩’為回交父本)試驗(yàn)結(jié)果可以綜合判斷油茶雜交F1代的繁育系統(tǒng)為專性異交型；人工授粉試驗(yàn)結(jié)果表明，雜交F1代雌配子育性良好，回交結(jié)實(shí)率高.這些結(jié)果為綜合利用親本的優(yōu)良性狀來創(chuàng)新種質(zhì)和遺傳改良創(chuàng)造了條件.