曾榮香，陳 麗，藍義琨，雷凱君

（廣東省佛山市中醫(yī)院藥劑科，廣東 佛山 528000）

地稔Melastoma dodecandrum Lour. 為野牡丹科植物地稔的全草[1]，喜酸性土壤，廣泛分布于江浙、兩廣、福建、貴州、湖南等地區(qū)，其味甘、微澀，性涼，具有清熱解毒消腫、活血祛瘀止血的功效，常用于治療高熱、療瘡癰腫、咽喉腫痛、痔瘡、毒蛇咬傷等癥[2]。地稔的多糖類成分藥理作用廣泛，如抗氧化、清除自由基、抗?jié)?、抗炎癥、抗腫瘤、抗衰老、降糖調(diào)脂等[3－4]。目前，對地稔活性成分的研究多集中于沒食子酸[5－6]，但對地稔多糖的研究報道不多。多糖的提取一般采用回流提取法，目前也有關(guān)于微波提取多糖的報道[7－9]。本研究中采用單因素考察比較微波提取和回流提取的多糖提取率，通過正交試驗優(yōu)選地稔多糖的最佳提取工藝?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：UV2550 型紫外可見分光光度計（日本島津公司）；BT25S 型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，精度為十萬分之一）；HWC－3LA 型微波提取設(shè)備（廣州興興微波能設(shè)備有限公司）；KDM 型控溫電熱套（山東華魯電熱儀器有限公司）；R－200 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（廈門精藝興業(yè)科技有限公司）；Sorvall Legend X1 型高速大容量離心機（德國Thermo 公司）；SZ －93 型自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）。

試藥：地稔飲片（廣州致信中藥飲片有限公司，批號為130801）；D－無水葡萄糖（中國藥品生物制品檢定所，批號為110833 －201204）；苯酚、濃硫酸、95%乙醇均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖含量測定

2.1.1 溶液制備

無水葡萄糖105 ℃干燥至恒重，取60.00 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用，即得對照品溶液。取樣品20 g，浸泡30 min，微波或回流提取，過濾，濃縮至20 mL，加4 倍量的95%乙醇，放置冰箱中醇沉過夜，離心，取沉淀稀釋至1 000 mL，再取10 mL 稀釋至100 mL，即得供試品溶液。

2.1.2 標準曲線繪制

分別精密量取葡萄糖對照品溶液1，2，3，4，5 mL，置50 mL 容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，再分別精密量取2 mL 置25 mL 具塞試管中，加5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加濃硫酸7.5 mL，搖勻，室溫放置15 min，置冷水中冷卻30 min 取出，以相應(yīng)試劑為空白，按分光光度法于490 nm 波長處測定吸光度[10]。以葡萄糖質(zhì)量濃度（C）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程A ＝0.047 3 C ＋0.057 4， R2＝0.998 2（n ＝5）。結(jié)果表明，葡萄糖溶液質(zhì)量濃度在12 ～60 μg／mL 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.1.3 樣品含量測定

精密吸取供試品溶液2 mL，置25 mL 具塞試管中，按標準曲線項下操作，代入回歸方程，計算含量。

2.2 單因素考察

2.2.1 微波提取

提取時間：取樣品20 g，按料液比1 ∶30 加水600 mL，每個條件取3 個平行，置微波提取設(shè)備中，在700 W 功率 下 分 別 提 取5，10，15，20，25 min， RSD 分 別 為1.46%，1.14%，0.67%，0.99%，2.52%（n ＝3）。由圖1可見，5 ～20 min 多糖提取率處于平穩(wěn)狀態(tài)，20 min 后呈下降趨勢，可能是較長時間的微波輻射使多糖的穩(wěn)定性下降，從而影響其含量，故微波提取時間不宜過長。

料液比：取樣品20 g，置微波提取設(shè)備中，在700 W功率下提取15 min，每個條件取3 個平行，分別按1 ∶10，1 ∶20，1 ∶30，1 ∶40 的比例加水提取，結(jié)果的RSD 分別為1.03% ，0.69% ，0.88% ，1.21% （n ＝3）。由圖2 可見，料液比對地稔多糖提取率的影響并不大。由于地稔飲片吸水性較強，為使藥材完全浸泡，故料液比1 ∶20相對較佳。

微波功率：取樣品20 g，按料液比1 ∶20 加水400 mL，每個條件取3 個平行，置微波提取設(shè)備中提取15 min，分別于400，500，600，700，800 W 提取功率下提取，結(jié)果的 RSD 分 別 為1.80% ，1.20% ，0.81% ，1.20% ，0.92% ( n ＝3）。由圖3 可見，多糖的提取率隨著微波功率的增大而升高，但700 W 后無顯著變化。

提取次數(shù)：取樣品20 g，按料液比1 ∶20 加水400 mL，每個條件取3 個平行，置微波提取設(shè)備中，在700 W 功率下提取15 min，分別提取1，2，3 次，結(jié)果的RSD 分別為0.91%，0.52%，0.42% ( n ＝3）。由圖4 可見，地稔多糖提取率隨提取次數(shù)的增多而升高。

2.2.2 回流提取

提取時間：取樣品20 g，按料液比1 ∶20 加水400 mL，每個條件取3 個平行，分別提取1，2，3，4，5 h ，結(jié)果的RSD 分別為0.86% ，1.88% ，1.60% ，2.87% ，1.12%( n ＝3）。由圖5 可見，1 ～2 h 多糖提取率顯著增加，而2 h后隨著時間的延長并無顯著變化，故提取2 h 最佳。

料液比：取樣品20 g，提取1 h，每個條件取3 個平行，分別按1 ∶10，1 ∶20，1 ∶30，1 ∶40 的比例加水提取，結(jié)果的 RSD 分別為0.93% ，0.59% ，0.64% ，0.37%( n ＝3）。由圖2 可見，料液比對地稔多糖提取率的影響不大，故1 ∶20 相對較佳。

提取次數(shù)：取樣品20 g，按料液比1 ∶20 加水400 mL，提取2 h，每個條件取3 個平行，分別提取1，2，3 次（結(jié)果的RSD 分別為0.30%，2.99%，2.26% ( n ＝3）。由圖4 可見，地稔多糖提取率隨提取次數(shù)的增多而升高。

2.2.3 微波輔助回流提取

取樣品20 g，按料液比1 ∶20 加水400 mL，先在700 W 功率下微波提取10 min，再回流提取2 h，平行3 次，結(jié)果的RSD 為1.03%( n ＝3）。

2.2.4 多糖提取率比較

由圖1 至圖5 可見，回流提取的多糖提取率增長趨勢比微波提取更顯著。由圖6 可見，微波輔助回流提取的多糖提取率并未高于回流提取。

2.3 正交試驗設(shè)計

圖1 微波提取時間對地稔多糖提取率的影響

圖2 料液比對地稔多糖提取率的影響

圖3 微波功率對地稔多糖提取率的影響

圖4 提取次數(shù)對地稔多糖提取的影響

圖6 微波輔助回流提取與回流提取的比較

圖5 回流提取時間對地稔多糖提取率的影響

由單因素考察試驗結(jié)果可見，回流提取比微波提取更適合地稔多糖的提取，故對回流提取進行正交設(shè)計優(yōu)化。選擇提取時間（因素A）、料液比（因素B）、提取次數(shù)（因素C）3 個因素為考察對象，每個因素擬3 個水平，選用L9（34）正交設(shè)計優(yōu)化回流提取工藝。因素水平見表1。正交試驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。可見，A 列K 值A(chǔ)3＞A2＞A1，B1、B2、B3相差不大，說明因素B 的三水平差不多；C 列K 值C3＞C2＞C1，說明C3比C1和C2好。由直觀分析表明，因素C 的極值R 最大，為主要影響因素，其次為因素A，最后是因素B。故各因素對提取效果的影響程度依次為C ＞A ＞B。由方差分析結(jié)果可見，因素A、因素C 是極顯著因素。綜合考慮，優(yōu)選出的最佳提取工藝為A2B1C3，即20 倍水量，提取3 次，每次2 h。

表1 L9（34）因素水平

表2 正交試驗方案與結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

2.4 驗證試驗

分別稱取同一批樣品20 g，平行3 份，用20 倍量水浸泡30 min，提取3 次，每次2 h。在此工藝下，地稔多糖的提取率為1.12%。

3 討論

目前，多糖提取方法有超聲提取法、回流提取法、微波提取法、酶提取法等，其中超聲提取技術(shù)可通過超聲波的空化作用及其次級效應(yīng)，如機械振動、擴散、乳化、擊碎、化學(xué)效應(yīng)等，促進植物有效成分溶出、擴散、釋放并與溶劑充分混合[11]。預(yù)試驗結(jié)果顯示，超聲提取地稔多糖效率很低，不利于提高藥材的使用率。微波提取是將微波射線輻射于溶劑，微波射線透過細胞壁到達細胞內(nèi)部，極性溶劑及細胞液可吸收微波能，導(dǎo)致細胞內(nèi)部及附近的溫度升高，細胞內(nèi)氣化壓力增大至超過細胞壁承受能力時，細胞壁破裂，細胞內(nèi)成分釋放轉(zhuǎn)移到溶劑中[12]。回流提取法是常規(guī)提取方法，操作簡單，成本較低。酶提取法提取條件溫和，提取率高，但工藝條件要求及成本也較高[13]，不利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

本試驗結(jié)果顯示，微波提取達到平衡態(tài)的時間雖比回流提取時間短，但提取率明顯低于回流提取，表明微波提取不適合地稔多糖。超聲提取法和微波提取法操作簡單，提取率高，但提取較劇烈，易造成多糖降解[14－15]。綜合回流提取的單因素試驗、正交試驗和實際應(yīng)用考慮，地稔多糖更適合的提取工藝為回流提取，最佳提取條件為料液比1 ∶20，提取3 次，每次提取2 h，此條件下的地稔多糖提取率約為1.1%。