朱嵩岳，伯 樂(lè)，楊光照，尹 娜，吳晨婷，茅彩萍

（蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，江蘇 蘇州 215006）

人類女性生殖系統(tǒng)比絕大部分機(jī)體系統(tǒng)衰老得更迅速，生殖能力與年齡呈負(fù)相關(guān)[1]。隨著年齡的增長(zhǎng)，卵母細(xì)胞、卵丘細(xì)胞和卵泡液中活性氧增加和抗氧化水平降低引起女性生殖系統(tǒng)氧化應(yīng)激壓力增高，生育能力降低[2]。目前，臨床主要治療手段有免疫治療、內(nèi)分泌治療等，有關(guān)中醫(yī)藥的治療較少。黃芪（AS）在臨床常用于防治免疫功能紊亂性疾病、心腦血管疾病、腫瘤等多種疾病，療效確切[3]。黃芪可發(fā)揮抗衰老作用，可能是通過(guò)抗氧化、調(diào)節(jié)免疫功能、改善衰老基因和相關(guān)酶表達(dá)、抑制端粒酶縮短等作用機(jī)制而實(shí)現(xiàn)[4－5]，但其對(duì)女性氧化應(yīng)激和卵巢生殖功能方面的作用未見(jiàn)報(bào)道。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪的安全有效劑量范圍為9 ～30 g[6]。故本研究中選取黃芪平均治療量為20 g，按體表面積換算，小鼠用量為400 mg／kg。D－半乳糖在半乳糖氧化酶作用下分解成過(guò)氧化氫和醛糖，導(dǎo)致機(jī)體活性氧和超氧自由基累積，氧化應(yīng)激增加，造成組織和細(xì)胞損傷，是用于構(gòu)建衰老小鼠的常用藥物[7]。本研究中探討了黃芪對(duì)卵巢衰老生殖功能的影響及機(jī)制，為臨床治療卵巢衰老提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：ETC811 型基因擴(kuò)增儀（蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司）；Gene Amp9700 型Q－PCR 儀（美國(guó)Applied Biosystems 公司）；TEC －VEMJ2 型全自動(dòng)組織包埋機(jī)（日本櫻花公司）。

試藥： D－半乳糖（D－Galaactose，T0591，批號(hào)為20160406，美國(guó)Targrt Mol 公司）；黃芪Astragalus membranaceus （Fisch.） Bge 干燥根提取物（b21616 －1g，批號(hào)為20160605，上海源葉生物科技有限公司）；孕馬血清促性腺激素（PMSG，P9970，批號(hào)為20161012，北京索萊寶科技有限公司）；人絨毛膜促性腺激素（HCG，BM0066，批號(hào)為20160815，武漢博士德生物工程有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒( 蘇州綠葉日用品有限公司)；RNeasy Mini Kit（74101，批號(hào)為A180502A，美國(guó)Qiagen 公司）；逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT－PCR)試劑盒（RR047A，批號(hào)為157019548， 日 本 Takara 公 司）； 引 物（ 批 號(hào) 為HG1811290022，南京銳真生物公司）。

動(dòng)物：60 只SPF 級(jí)ICR 雌性小鼠和10 只SPF 級(jí)ICR 雄性小鼠，8 周齡，體質(zhì)量（22.1 ±2.9）g，購(gòu)自昭衍（蘇州）新藥研究中心有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（蘇）2018 －0006。自由飲食飲水，期間喂食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為18 ～25 ℃，相對(duì)濕度為40% ～60%，光照周期12 h ∶12 h。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均按蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)規(guī)定進(jìn)行。

1.2 方法

動(dòng)物模型建立：選取60 只8 周齡ICR 雌鼠，體質(zhì)量均在（22 ±3）g，隨機(jī)分為空白對(duì)照（CON）組、衰老模型（ D － gal）組、黃芪治療組（ D － gal ＋AS）組，每組20 只。在相同環(huán)境下飼養(yǎng)，飼料和水均經(jīng)過(guò)滅菌處理。D －gal 組皮下注射D－gal[（200 mg／（kg·d）]42 d，超純水灌胃（每10 g 體質(zhì)量0.2 mL）30 d，小鼠出現(xiàn)精神萎靡、毛色枯黃、行動(dòng)遲緩等現(xiàn)象為造模成功；空白對(duì)照組注射與D －gal 組等體積的生理鹽水42 d，超純水灌胃（每10 g 體質(zhì)量0.2 mL）30 d；D －gal ＋AS 組皮下注射D－gal[200 mg（kg·d）]42 d，黃芪[400 mg／（kg·d）]灌胃（每10 g 體質(zhì)量0.2 mL）30 d。

體外受精實(shí)驗(yàn)：造模后，各組均取6 只小鼠腹腔注射PMSG 0.1 mL（5 U），48 h 后，注射HCG 0.1 mL（5 U）。在注射PMSG 后第4 天清晨9：00，處死小鼠，取出卵丘－卵泡復(fù)合物；同時(shí)，處死雄鼠，取附睪尾內(nèi)精子在體外與卵丘－卵泡復(fù)合物結(jié)合6 h 后置二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱（CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，溫度為37 ℃）培養(yǎng)，并將受精卵體外培養(yǎng)至囊胚階段，觀察受精卵及各階段胚胎情況，計(jì)數(shù)并比較各組的二細(xì)胞數(shù)、四細(xì)胞數(shù)及囊胚數(shù)。

血清和卵巢SOD 和MDA 檢測(cè)：其余小鼠頸部脫臼法處死后收集血樣，離心，取上清液；同時(shí)，取卵巢組織，迅速用生理鹽水洗凈，在冰上用小組織剪剪碎，放入勻漿管，用勻漿機(jī)勻漿，取上清液；上清液行SOD 活性、MDA 含量測(cè)定。操作方法均嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

囊胚相關(guān)氧化應(yīng)激基因mRNA 表達(dá)檢測(cè)：用研缽在液氮環(huán)境下將體外培養(yǎng)的囊胚組織研磨成粉末，放入1.5 mL 無(wú)RNA 酶離心管內(nèi)，用RNeasy Mini Kit 試劑盒提取RNA，用RT －PCR 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于目的基因擴(kuò)增，用Q －PCR 儀連續(xù)熒光檢測(cè)擴(kuò)增，程序設(shè)定為UDG 酶激活50 ℃，時(shí)間2 min，預(yù)變性溫度95 ℃，時(shí)間2 min；變性溫度95 ℃，3 s，退火、延伸，溫度60 ℃，30 s，持續(xù)40 個(gè)循環(huán)，于60 ℃處收集熒光，每個(gè)樣本均以β－actin 作為對(duì)照，行三復(fù)孔檢測(cè)。采用Graph Pad Prism7 軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，行LSD － t 檢驗(yàn)和單因素方差（ANOVA）分析。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

連續(xù)造模42 d 后，各組小鼠均未出現(xiàn)嘔吐、拒食等病理情況。

2.2 促排卵后體外受精結(jié)果

3 組小鼠平均排卵數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞0.05）；與CON 組相比，D －gal 組小鼠平均二細(xì)胞數(shù)、四細(xì)胞數(shù)及囊胚數(shù)均顯著減少（P ＜0.05）；D－gal ＋AS 組中二細(xì)胞數(shù)、四細(xì)胞數(shù)及囊胚數(shù)較D－gal 組顯著增加（P ＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 3 組小鼠排卵數(shù)及早期胚胎各階段正常胚胎數(shù)（± s，n ＝6）

表1 3 組小鼠排卵數(shù)及早期胚胎各階段正常胚胎數(shù)（± s，n ＝6）

注：與D －gal 組相比， P ＜0.05。圖1 和圖2 同。

組別CON 組D－gal 組D－gal ＋AS 組排卵數(shù)29.55±2.84 25.16±3.51 32.12±4.05二細(xì)胞數(shù)20.91±4.48 16.27±4.27 26.50±5.43四細(xì)胞數(shù)20.61±4.18 14.27±3.69 23.38±5.74囊胚數(shù)16.05±6.34 9.66±1.66 17.77±3.99

2.3 小鼠血清、卵巢、囊胚中SOD 和MDA 水平

D －gal 組小鼠血清中SOD 水平較CON 組顯著降低（P ＜0.05），D－gal ＋AS 組較D－gal 組SOD 水平顯著升高；D－gal 組中MDA 水平較正常組顯著升高（P ＜0.05），D － gal ＋AS 組MDA 水 平 較 D － gal 組 顯 著 降 低（P ＜0.05）。 D－gal 組小鼠卵巢組織中SOD 水平較CON 組顯著降低（P ＜0.05），D －gal ＋AS 組較D－gal組SOD 水平顯著升高（P ＜0.01）；D－gal 組中MDA 水平較CON 組顯著升高（P ＜0.05），D －gal ＋AS 組MDA水平較 D－gal 組顯著降低（P ＜0.05）。 D －gal 組與CON 組相比，囊胚SOD1和SOD2基因表達(dá)水平顯著降低（P ＜0.05）；與D －gal 組相比，D－gal ＋AS 組中囊胚SOD1和SOD2表達(dá)水平顯著升高（P ＜0.05）。詳見(jiàn)圖1 和圖2。

圖1 3 組小鼠血清、卵巢、囊胚中SOD 和MDA 水平（n ＝14）

圖2 囊胚中SOD1 和SOD2 表達(dá)水平（n ＝14）

3 討論

高齡所伴隨著的卵巢衰老是影響生殖健康的重要原因[1]。卵巢衰老直接影響卵子質(zhì)量，而卵子老化導(dǎo)致卵母細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)異常、紡錘體及染色體排列異常、活性氧（ROS）增加等問(wèn)題，進(jìn)一步導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，可能出現(xiàn)低生育率、胚胎發(fā)育異常和先天性缺陷等生殖相關(guān)疾病，其中最主要的原因是ROS 增加[8－9]。機(jī)體一般處于ROS 平衡狀態(tài)，即抗氧化水平與氧化水平持平，但當(dāng)抗氧化水平降低或氧化水平增高時(shí)，則會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的ROS，會(huì)對(duì)機(jī)體中的DNA、脂質(zhì)等大分子造成損害[10]。脂質(zhì)氧化最終產(chǎn)物為MDA，是機(jī)體氧化程度判定的重要指標(biāo)之一，過(guò)量的MDA 會(huì)破壞細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸，D －半乳糖可能產(chǎn)生過(guò)量的超氧陰離子和過(guò)氧化氫，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化物在細(xì)胞膜中過(guò)量沉積，從而增加了MDA 的含量[11]。SOD 是機(jī)體最重要的抗氧化酶之一，是抵擋ROS 的第一道防線，催化超氧化物向過(guò)氧化氫轉(zhuǎn)化，對(duì)于正常細(xì)胞功能有重要意義[12]。當(dāng)MDA代謝過(guò)量和SOD 水平下降時(shí)，則表示機(jī)體氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)，ROS 增加，引發(fā)衰老[13]。

黃芪多糖、黃芪提取物均有抗衰老、降低氧化應(yīng)激水平的功能[14]，主要是通過(guò)清除多余的ROS 及改善線粒體功能障礙等途徑，最終改善機(jī)體能量代謝[15]。本研究結(jié)果顯示，黃芪改善了小鼠胚胎的發(fā)育能力，增強(qiáng)了抗氧化酶的活性，且減少了氧化代謝產(chǎn)物的減少，表明黃芪改善了衰老小鼠卵母細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)，增強(qiáng)了卵母細(xì)胞的抗氧化能力，促進(jìn)受精卵的成熟。初步推測(cè)與相關(guān)基因上調(diào)有關(guān)。

褪黑素可通過(guò)降低生殖系統(tǒng)氧化應(yīng)激、去除ROS及抗卵母細(xì)胞凋亡等途徑實(shí)現(xiàn)改善小鼠生殖功能的作用，其主要功能蛋白為SOD2；同時(shí)，SOD2蛋白將體內(nèi)代謝生成的超氧化物轉(zhuǎn)變成過(guò)氧化物，在過(guò)程中產(chǎn)生的超氧陰離子和過(guò)氧化氫對(duì)卵泡發(fā)育也起到了關(guān)鍵作用[16]。體外培養(yǎng)的囊胚在黃芪的作用下，SOD1和SOD2基因表達(dá)增加，表明黃芪通過(guò)增加SOD 基因的表達(dá)也發(fā)揮了類似褪黑素的功能。目前，SOD1的功能尚不明確，但應(yīng)注意卵丘細(xì)胞SOD1蛋白活性降低會(huì)導(dǎo)致體外受精－胚胎移植術(shù)（IVF－ET）成功率下降[17]，可推斷黃芪可能會(huì)影響IVF －ET 的成功率，但仍需后續(xù)研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，黃芪可能通過(guò)增強(qiáng)抗氧化基因的表達(dá)，降低衰老小鼠的全身氧化應(yīng)激作用，改善其生殖功能，均為臨床黃芪治療卵巢衰老提供了理論基礎(chǔ)。