程艷 余曉紅

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科 鄭州 450052

靶向基因治療是使正?；蛲ㄟ^分子生物工程或治療在腫瘤細胞中借Yinte遠程作用的手段，抑制致瘤基因或修復(fù)有缺陷的基因，使腫瘤細胞的生長受到抑制，而不影響正常細胞。國內(nèi)外研究表明，孕酮受體膜成分(PGRMC1)和惡性腫瘤關(guān)系密切，在卵巢癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、子宮頸癌和其他惡性腫瘤中呈高表達，但確切的作用機制尚不清楚[1-3]。我們通過構(gòu)建靶向PGRMC1基因shRNA 真核表達載體,以期抑制PGRMC1基因表達而使PGRMC1基因表達下調(diào)，為PGRMC1開展卵巢癌基因治療奠定基礎(chǔ)和提供實驗工具。

1 材料與方法

1.1材料與試劑人卵巢癌細胞株SKOV3細胞系購自上海研究所。RPMI1640培養(yǎng)基，新生小牛血清，逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR試劑盒購自美國Gibco公司。限制性內(nèi)切酶， DNA連接酶購自上海生工有限公司。脂質(zhì)體Lipofectamine2000 ， TRIzol試劑的產(chǎn)品，空載體pcDNA3.1A購自美國Introvigen公司 。四氮唑藍(MTT)，氨基糖苷類抗生素G418購自Sigma公司。

1.2PGRMC1基因的設(shè)計和合成從GenBank獲取PGRMC1 mRNA 的完整序列。根據(jù)Tuschl設(shè)計原則[4],設(shè)計3條shRNA (short hairp in RNA),特異性干擾PGRMC1基因3段不同序列。設(shè)計另1條shRNA 干擾選中的shRNA 中的堿基序列作為陰性對照,經(jīng)BLAST檢索確定且與PGRMC1 mRNA 及其他基因編碼序列無同源性。按照該試劑盒的使用說明，用TRIzoL 試劑提取RNA。其中1μg總RNA 在SuperScrip tTM Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA。PCR 引物用于擴增靶向和對照序列產(chǎn)物(引物序列PGRMC1正義鏈5'-GCTCTGGCTTTGCATTTGATGCA-3 ' ，反義鏈5'- AGGAGCAGAAGTTTGAAC -3')。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞，漂洗2次，用冷PBS后，將細胞裂解，提取總蛋白。該產(chǎn)品12%的SDS-PAGE ，以蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移儀將產(chǎn)物轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上,加入孕酮受體膜成分的抗體(1∶ 1000～1200)，4℃反應(yīng)過夜，PBST洗膜，和1∶ 4000山羊抗兔IgG / HRP室溫下攪拌12 h，用化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)5 min，用發(fā)光成像儀成像。

2 結(jié)果

2.1PCR擴增PGRMC1基因的開放閱讀框結(jié)果RT-PCR擴增的PGRMC1產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析, 發(fā)現(xiàn)所擴增的條帶特異性強, 大小為2000 bp, 與預(yù)期的大小一致。見圖1。

1. PGRMC1 PCR 產(chǎn)物 M: DNA Marker

圖1 PGRMC1基因的PCR擴增結(jié)果

2.2組件的構(gòu)建和鑒定重組質(zhì)粒pcDNA3.1 (-)/PGRMC1 PRGMC1測序克隆pcDNA3.1 (-)/PGRMC1的表達載體，所述重組質(zhì)粒pcDNA3.1 (-)/PGRMC1。PCR實驗陽性的菌落提取質(zhì)粒DNA，用限制性酶MsqI酶切位點的酶和Smo I雙重消化，結(jié)果顯示，PGRMC1成功地建立到pcDNA3.1 (-)的真核表達載體中。

2.3篩選的細胞系和鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染將pcDNA3.1 (-)/孕酮受體膜成分質(zhì)粒轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞系SKOV3，培養(yǎng)4周后，將孕酮受體膜成分陽性細胞穩(wěn)定表達株。通過RT-PCR和轉(zhuǎn)染的pcDNA3.1的Western印跡分析(-)/孕酮受體膜成分SKOV3細胞與SKOV3細胞轉(zhuǎn)染空載體相比，表達的兩個內(nèi)部基準電平基本上是相同的；而前者孕酮受體膜成分-基因表達水平顯著增加，表明重組質(zhì)粒已經(jīng)成功傳遞到表達(圖3，圖4)和SKOV3細胞系。

1: 未酶切的pcDNA3.1(-)/PGRMC1

Undigestion of pcDNA3.1(-)/PGRMC1

2: MspI 和SmoI雙酶切后的pcDNA3.1(-)/PGRMC1

MspI and SmoI digestion of pcDNA3.1(-)/PGRMC1

3: PGRMC1 PCR 產(chǎn)物product M: DNA marker

圖2 pcDNA3.1(-)/PGRMC1 雙酶切鑒定結(jié)果

圖3 通過RT-PCR檢測在PGRMC1的表達 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SKOV3細胞系

圖4 免疫印跡檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染前，后SKOV3細胞系中的PGRMC1基因表達

3 討論

PGRMC1是一類小分子蛋白，含有194個氨基酸，包括1個N端跨膜結(jié)構(gòu)域，1個細胞色素b5樣或亞鐵血紅/類固醇結(jié)合域。PGRMC1主要分布在后期卵黃的卵巢、肝臟和頭腎。研究發(fā)現(xiàn)，PGRMC1在乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、宮頸癌等惡性腫瘤組織中呈過度表達，動物實驗發(fā)現(xiàn)PGRMC1在卵巢中含量比較大[4-5]。且PGRMC1在卵巢癌組織中普遍呈過度表達，可促進卵巢癌細胞的增殖。PGRMC1不僅與孕激素結(jié)合，還可以與其他甾體和非甾體類物質(zhì)結(jié)合。有研究發(fā)現(xiàn)，PGRMC1可以促進卵巢癌的發(fā)生，敲除此基因后，卵巢癌細胞的增殖受到抑制，順鉑的敏感性會增加。提出削弱PGRMC1的作用，有望作為卵巢癌靶向治療及輔助化療的一部分[6-8]。

在此研究中，我們成功構(gòu)建PGRMC1到真核表達載體pcDNA3.1(-)中，通過限制性內(nèi)切酶鑒定，測序，證實了靶基因的PRGMC1的正確序列，成功地建立了穩(wěn)定整合在基因組中的DNA染pcDNA3.1(-)/PGRMC1-SKOV3細胞克隆時，細胞克隆的細胞進行培養(yǎng)，用RT-PCR和Western blot檢測PRGMC1高表達的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞。

本實驗構(gòu)建的載體經(jīng)PCR電泳圖譜和測序證實了克隆RNAi打靶序列完全正確, 合成的寡核苷酸已成功載入載體。通過構(gòu)建shRNA真核表達載體,成功地阻抑了PGRMC1基因在人卵巢癌細胞SKOV3中的表達,成功構(gòu)建的pcDNA3.1(-) / PGRMC1 質(zhì)粒 SKOV3細胞系為研究PGRMC1調(diào)節(jié)卵巢癌的分子機制及下游基因奠定了基礎(chǔ)，為進一步研究PGRMC1基因在腫瘤細胞發(fā)生和惡性進展的作用及探討卵巢癌基因治療新方法提供了可能。