23蔡巧燕23沈阿靈2褚劍鋒23彭 軍23

高血壓是最為常見的心腦血管疾病，它是威脅人類生命健康的重要疾病之一，也是損害人體重要靶器官如心、腦、腎等的元兇。研究表明，在高血壓狀態(tài)下，腦部會出現(xiàn)不同程度的出血性或缺血性損傷等高血壓并發(fā)癥[1]，在發(fā)生損傷時，體內或細胞內自由基和丙二醛等有害化學基團迅速增多，導致線粒體功能障礙，加重細胞興奮毒性，促進神經元脂質、蛋白質和 DNA過氧化損傷和炎癥反應[2]，并進一步造成細胞損傷和壞死以及腦血管病變，最終對大腦皮層造成損傷[1]。因此，抗氧化損傷是防治由高血壓引起的腦損傷并發(fā)癥的重要措施之一。通過抗氧化治療清除由于腦損傷增多的自由基，并抑制其生成從而減輕活性氧(ROS)在腦內蓄積引起的細胞毒性反應[3]，生成抗氧化物質來防御神經元脂質、DNA和蛋白質造成的氧化損傷，起到保護神經細胞的作用，進而減輕腦組織損傷[4]。p38MAPK/Nrf2/HO-1通路被證實與諸多器官的抗氧化應激損傷有關，該通路的下游產物血紅素加氧酶(HO-1)是經典的抗氧化劑酶，具有良好的抑制氧化應激及炎癥的作用[5]。

清達顆粒(QDG)是由陳可冀院士運用幾十年的臨床經驗方清眩降壓湯化裁而成，由天麻、鉤藤、黃芩、蓮子心4味藥物組成，具有清肝熱、平肝陽、泄心火之功效。有研究表明清達顆?？捎行Э刂谱园l(fā)性高血壓大鼠血壓對心、腎等靶器官的損害[6]。而方中單味藥的有效成分如天麻素、黃芩苷、異鉤藤堿等均可對細胞炎癥反應及氧化損傷有一定的抑制功效[7-10]，甲基蓮心堿亦對神經細胞有明確的抗氧化應激功效[11]。但是目前對清達顆粒本身潛在的抗氧化應激功效研究尚不充分。本研究擬通過脂多糖(LPS)誘導小鼠腦小膠質細胞株構建細胞炎癥反應模型，觀察清達顆粒對炎癥細胞抗氧化應激的影響，并探究其對p38MAPK/Nrf2/HO-1信號轉導通路活化的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物與細胞株 清達顆粒是由天麻12 g、鉤藤10 g、黃芩6 g、蓮子心5 g配伍制成的顆粒制劑，由江陰天江藥業(yè)有限公司生產，批號：CKJ2017001；小鼠小膠質細胞株BV-2，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 實驗試劑 RPIM 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、EDTA-0.25%胰蛋白酶、雙抗(青-鏈霉素混合液)，美國Hyclone公司；LPS，美國Sigma公司；MTT粉末，美國Sigma公司；ROS、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒，南京建成生物科技有限公司；細胞核蛋白質提取試劑盒，生工生物工程股份有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，碧云天生物技術公司；p-p38(4511S)、p38(8690S)、TBP(8515S)，美國CST公司；Nrf2(16396-1-AP)、HO-1(10701-1-AP)，美國proteintech公司；小鼠/大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(貨號VAL609)，NOVUS公司；p38MAP激酶抑制劑(LY2228820，貨號A5566)，Apexbio公司。

1.3 實驗儀器 細胞培養(yǎng)箱、超微量高精度紫外/可見光分光光度計，美國Thermo公司；CaryEclipse熒光分光光度計，美國Varian公司；超凈工作臺，蘇州市安泰儀器設備有限公司；EK800酶標儀，美國基因有限公司；蛋白電泳儀，美國Bio-Red公司。

1.4 清達顆粒母液的制備 稱取清達顆粒粉末5 mg，加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)溶液至1 mL，置于超聲儀器溶解30 min，獲得濃度為5 mg/mL的清達顆粒母液，放置于-20 ℃冰箱中保存待用。

1.5 BV-2細胞培養(yǎng)與傳代 BV-2小鼠小膠質細胞貼壁培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)、1%雙抗的RPMI-1640，置于含5%二氧化碳(CO2)、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液。每隔2 d傳代，待細胞處于對數(shù)生長期時用于實驗。

1.5.1 MTT法檢測不同濃度LPS對BV-2細胞的細胞活力影響 BV-2細胞以每孔1.5×105個密度，每孔100 μL，接種于96孔板。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，吸去上清液，換成空白培養(yǎng)基孵育4 h。吸去上清液后加入含有LPS (1 μg/mL、3 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL)的完全培養(yǎng)基，空白對照組則加入完全培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h后，吸去上清液 ，每孔加入0.5 mg/mL MTT 溶液100 μL。37 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加入100 μL 二甲基亞砜(DMSO)充分振蕩 10 min 溶解結晶，用酶標儀在570 nm 處測定吸光度。

1.5.2 MTT法檢測不同濃度清達顆粒對BV-2細胞的細胞活力影響 BV-2細胞以每孔1.5×105密度，每孔100 μL，接種于96孔板。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，吸去上清液，換成空白培養(yǎng)基孵育4 h。吸去上清液后加入含有清達顆粒(31.25 μg/mL、62.50 μg/mL、125.00 μg/mL、250.00 μg/mL、500.00 μg/mL)的完全培養(yǎng)基中，空白對照組則加入完全培養(yǎng)基中，繼續(xù)孵育24 h后，吸去上清液，每孔加入0.5 mg/mL MTT 溶液100 μL。37 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，棄去上清液，每孔加入100 μL DMSO 充分振蕩 10 min 溶解結晶，用酶標儀在570 nm 處測定吸光度。

1.5.3 MTT法檢測清達顆粒對LPS干預的BV-2細胞的細胞活力影響 根據實驗結果，選擇1 μg/mL LPS以及31.25 μg/mL、62.50 μg/mL、125.00 μg/mL 3個濃度的QDG溶液進行干預實驗。BV-2細胞以每孔1.5×105密度，每孔100 μL，接種于96孔板。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，吸去上清液，換成空白培養(yǎng)基孵育4h。吸去上清液后分別加入清達顆粒(31.25 μg/mL、62.50 μg/mL、125.00 μg/mL)和/或1 μg/mL LPS，還有一組加入完全培養(yǎng)基作為空白對照組，繼續(xù)孵育24 h后，吸去上清液，每孔加入0.5 mg/mL MTT 溶液100 μL。37 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，棄上清液，每孔加入100 μL DMSO 充分振蕩 10 min 溶解結晶，用酶標儀在570 nm 處測定吸光度。

1.5.4 ROS含量檢測 分為空白對照組，模型組(LPS 1 μg/mL)，給藥組包括LPS 1 μg/mL+QGD 31.25 μg/mL組、LPS 1 μg/mL+QGD 62.50 μg/mL組、LPS 1 μg/mL+QGD 125.00 μg/mL組，每組3個復孔。將細胞等密度地接種至12孔板中，每孔1 mL，密度大約為 1.5×105個/孔，置于恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)18 h后，將培養(yǎng)基更換為無血清的培養(yǎng)基饑餓4 h，棄去上清液，按照分組加藥孵育23 h 30 min，將 12 孔板中的培養(yǎng)基換為含有10 μmol/LDCFH-DA 的PBS繼續(xù)孵育30 min，之后將PBS吸出，使用胰酶消化細胞，加入培養(yǎng)基終止消化，制成細胞懸液，離心5～10 min收集細胞，用PBS洗滌1次或2次，離心收集細胞沉淀物用PBS重懸后用于熒光分光光度計檢測。最佳激發(fā)波長485(500±15) nm，最佳發(fā)射波長525(530±20) nm。

1.5.5 ELISA檢測細胞上清液中TNF-α濃度 分為空白對照組、模型組(LPS 1 μg/mL)、給藥組不同劑量亞組即LPS 1 μg/mL+QGD 31.25 μg/mL組、LPS1 μg/mL+QGD 62.50 μg/mL組、LPS 1 μg/mL+QGD 125.00 μg/mL組，每組3個復孔。等密度接種至12孔板，置于恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)18 h 后將培養(yǎng)基更換為空白培養(yǎng)基饑餓4 h，棄去上清液，按照分組加藥孵育24 h，吸取上清液，轉移至對應的1.5 mL離心管中，按照ELISA試劑盒說明對樣本進行處理后采用酶標儀進行讀數(shù)(波長450 nm)，再根據試劑盒提供的換算公式得出結果。

1.5.6 MDA含量測定 分為空白對照組，模型組(LPS 1 μg/mL)，給藥組(LPS 1 μg/mL+QGD 31.25 μg/mL組、LPS1 μg/mL+QGD 62.50 μg/mL組、LPS 1 μg/mL+QGD 125.00 μg/mL組)，每組3個復孔。將細胞等密度地接種至12孔板中，置于恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)18 h 后將培養(yǎng)基更換為無血清的培養(yǎng)基饑餓4 h，棄去上清，按照分組加藥孵育24 h，吸取上清液，轉移至對應的1.5 mL離心管中，按照試劑盒說明對樣本進行處理后采用酶標儀進行讀數(shù)(波長532 nm)。計算公式為細胞上清液中MDA含量=(測定OD值-對照OD值)/(標準OD值-空白OD值)×標準品濃度×樣本測試前稀釋倍數(shù)。

1.5.7 GSH-Px含量測定 按空白對照組、模型組(LPS 1 μg/mL)、給藥組(LPS 1 μg/mL+QGD 31.25 μg/mL組、LPS1μg/mL+QGD62.50μg/mL組、LPS1 μg/mL+QGD 125.00 μg/mL組)分為5組，每組3個復孔。將細胞等密度地接種至12孔板中，置于恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)18 h 后將培養(yǎng)基更換為無血清的培養(yǎng)基饑餓4 h，棄去上清液，按照分組加藥孵育24 h ，吸取上清液，轉移至對應的1.5 mL離心管中，按照試劑盒說明對樣本進行處理后采用酶標儀進行讀數(shù)(波長412 nm)。計算公式：培養(yǎng)上清液中GSH-Px活力單位=(非酶管OD值-酶管OD值)/(標準管OD值-空白管OD值)×標準管濃度(20 μmol/L)×稀釋倍數(shù)×樣本測試前稀釋倍數(shù)。

1.5.8 Western Blot法檢測 Nrf2、細胞核內Nrf2、p38、p-p38、HO-1蛋白表達及p38抑制劑(LY2228820)干預LPS誘導的BV-2細胞后HO-1蛋白的表達情況 細胞鋪板后匯合度至40%～50%時，吸去上清液，換成空白培養(yǎng)基饑餓4 h，之后將清達顆粒母液(5 mg/mL)化凍后依照實驗目的用完全培養(yǎng)基分別稀釋至31.25 μg/mL、62.50 μg/mL、125.00 μg/mL 3個干預濃度，并按組分別換液，另外，空白對照組及LPS組則用完全培養(yǎng)基換液，每組3個復孔。再加入QDG 12 h后，除空白對照組外每孔分別加入20 μL脂多糖母液(1 mg/mL)。檢測p38、p-p38、Nrf2、HO-1以及細胞核內Nrf2指標的細胞均繼續(xù)孵育12 h。后用NP-40蛋白裂解液裂解細胞，每5 min震蕩1次，裂解15 min，4 ℃下14 000 r/min離心20 min，吸取上清液獲取總蛋白。核蛋白則采用細胞核蛋白提取法提取，之后根據BCA蛋白定量結果上樣。95 ℃變性5 min，SDS-PAGE 凝膠電泳，濕法轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h ，4 ℃一抗孵育過夜，TBST洗5 min×3次，室溫孵育二抗1 h，TBST洗5 min×3次，曝光顯影，采用 BIO-RAD Image Lab 軟件進行灰度值分析。

2 結 果

2.1 不同濃度LPS對BV-2細胞的細胞活力影響 LPS濃度處于1 μg/mL及以下時對 BV-2 細胞不造成毒性，可在此濃度范圍內用于后續(xù)細胞實驗的干預。LPS組(3 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL)BV-2細胞的細胞活力分別為(85±4)%、(72±2)%、(70±6)%，與空白對照組(100±6)%比較均下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，LPS濃度為1 μg/mL時細胞活力為(91±7)%，與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見圖1。

與空白對照組比較，*P<0.05。圖1 不同濃度LPS對BV-2細胞的細胞活力影響

2.2 不同濃度清達顆粒對BV-2細胞的細胞活力影響 清達顆粒濃度處于125 μg/mL及以下時對BV-2細胞不造成毒性，可在該濃度范圍內用于后續(xù)細胞實驗的干預。清達顆粒組(31.25 μg/mL、62.50 μg/mL、125.00 μg/mL)BV-2細胞的細胞活力分別為(100±5)%、(98±10)%、(92±3)%，與空白對照組細胞活力(100±3)%相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。QDG250.00 μg/mL組、500.00 μg/mL組細胞活力分別為(84±7)%、(68±2)%，與空白對照組比較下降，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見圖2。

與空白對照組比較，*P<0.05。圖2 不同濃度清達顆粒對BV-2細胞的細胞活力影響

2.3 清達顆粒對LPS干預的BV-2細胞的細胞活力影響 LPS(1 μg/mL)與清達顆粒(31.25 μg/mL、62.50 μg/mL、125.00 μg/mL)共同干預時對BV-2細胞不造成毒性。LPS組的BV-2細胞活力為(106±3)%，與空白對照組細胞活力(100±2)%比較，差異無統(tǒng)計學意義；LPS+QDG組(31.25 μg/mL、62.50 μg/mL、125.00 μg/mL)細胞活力分別為(107±2)%、(122±2)%、(109±3)%，與LPS組相比差異無統(tǒng)計學意義，LPS+QDG 62.5 μg/mL組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見圖3。

與空白對照組比較，*P<0.05。

2.4 清達顆粒對LPS干預的BV-2細胞中ROS含量影響 LPS組BV-2細胞中ROS熒光強度與空白對照組比較升高(P<0.01)；LPS+QDG(31.25 μg/mL、62.50 μg/mL)組與LPS組相比下降(P<0.01)。詳見圖4。

與LPS組比較，*P<0.01；與空白對照組比較，#P<0.01。 圖4 清達顆粒對LPS干預的BV-2細胞中釋放的ROS熒光強度

2.5 清達顆粒對LPS干預的BV-2細胞上清液中TNF-α濃度影響 LPS組BV-2細胞上清液中TNF-α濃度與對照組比較升高(P<0.01)；LPS+QDG組(31.25 μg/mL、62.50 μg/mL、125.00 μg/mL)與LPS組相比下降(P<0.01)。詳見表1。

組別樣本量(份)TNF-α濃度(pg/mL)MDA(nmol/mL)GSH-Px活力單位空白對照組3326.00±6.121.30±0.3017.07±1.22LPS組31 428.00±12.12②2.00±0.02①11.38±1.41①LPS+QDG 31.25 μg/mL組3 985.10±50.01④1.33±0.20③8.33±3.35LPS+QDG 62.50 μg/mL組3909.34±8.87④1.26±0.11③20.32±5.63④LPS+QDG 125.00 μg/mL組3849.74±8.34④1.89±0.2519.51±3.22④

與空白對照組比較，①P<0.05，②P<0.01；與LPS組比較，③P<0.05，④P<0.01。

2.6 清達顆粒對LPS干預的BV-2細胞上清液中MDA含量的影響 LPS組的BV-2細胞上清液中MDA含量與空白對照組比較升高(P<0.05)；LPS+QDG(31.25 μg/mL、62.50 μg/mL、125.00 μg/mL)組與LPS組相比均下降(P<0.05)。詳見表2。

2.7 清達顆粒對LPS干預的BV-2細胞中GSH-Px含量的影響 LPS組的BV-2細胞上清液中GSH-Px活力單位與空白對照組比較降低(P<0.05)；LPS+QDG組(62.50 μg/mL、125.00 μg/mL)與LPS組相比上升(P<0.01)。詳見表3。

2.8 清達顆粒對LPS干預的BV-2細胞的Nrf2、細胞核內Nrf2、p38、p-p38、HO-1蛋白表達的影響以及p38抑制劑作用下清達顆粒干預LPS誘導的BV-2細胞HO-1蛋白表達的影響 LPS組BV-2細胞中p-p38蛋白的表達與空白對照組比較下降(P<0.05)；LPS+QDG組(31.25 μg/mL、62.50 μg/mL、125.00 μg/mL)與LPS組相比上升(P<0.05)。詳見圖5。

LPS組BV-2細胞核中Nrf2蛋白的表達與空白對照組比較降低(P<0.05)；LPS+QDG組(31.25 μg/mL、125.00 μg/mL)與LPS組相比上升(P<0.05)。詳見圖6。

LPS組BV-2細胞中HO-1蛋白的表達與空白對照組比較降低(P<0.05)；LPS+QDG組(31.25 μg/mL、62.50 μg/mL、125.00 μg/mL)與LPS組相比上升(P<0.05)。詳見圖7。

LPS組的BV-2細胞中HO-1蛋白表達與空白對照組比較降低(P<0.05)；LY2228820+LPS組的BV-2細胞中HO-1蛋白表達與LPS組比較降低(P<0.05)；LY2228820+LPS+QDG(62.50 μg/mL)組與LPS+QDG(62.50 μg/mL)組相比下降(P<0.05)；LY2228820+LPS+QDG(62.50 μg/mL)組與LY2228820+LPS組相比明顯升高(P<0.05)。詳見圖8。

與LPS組比較，*P<0.05；與空白對照組比較，#P<0.05。 圖5 清達顆粒對LPS干預的BV-2細胞中p38、磷酸化p38蛋白表達的影響

與LPS組比較，*P<0.05；與空白對照組比較，#P<0.05。圖6 清達顆粒對LPS干預的BV-2細胞中Nrf2以及細胞核中Nrf2蛋白表達的影響

與LPS組比較，*P<0.05；與空白對照組比較，#P<0.05。圖7 清達顆粒對LPS干預的BV-2細胞中HO-1蛋白表達的影響

與LPS組比較，*P<0.05；與空白對照組比較，#P<0.05。 圖8 p38抑制劑干預后清達顆粒對LPS干預的BV-2細胞中HO-1蛋白表達的影響

3 討 論

高血壓可引起多種靶器官損害，高血壓性腦損傷即為其諸多并發(fā)癥之一。近年來研究表明，當人體處于高血壓狀態(tài)下，體內會釋放更多的ROS，產生大量自由基、脂質過氧化物等有害化學基團，機體無法及時清除它們，氧化代謝平衡被打亂，從而進入氧化應激狀態(tài)[12]。腦部相較其他器官此種現(xiàn)象更為嚴重[13]，腦內神經細胞因有害化學基團堆積而產生細胞毒性，構成細胞的物質如脂質、蛋白、DNA、RNA出現(xiàn)損傷，線粒體功能出現(xiàn)障礙，造成細胞損傷和壞死，進而損傷神經及腦血管，最終可造成大腦皮層的損害[1]。不僅如此，因高血壓所釋放的ROS也會激活如p53、NF-κB等多種信號通路導致細胞凋亡[14]。由此可見，高血壓所致的氧化應激損傷是造成腦損傷的重要原因之一。

小膠質細胞是腦內的一種神經膠質細胞。當高血壓等疾病造成腦內ROS大量釋放時，小膠質細胞會因其刺激過度活化，釋放大量氧自由基等有害化學基團以及大量有神經毒性的炎癥介質，加重炎癥及氧化應激，形成惡性循環(huán)，加劇顱腦損傷[15]。因此，本研究中將小膠質細胞作為研究對象，通過抗氧化治療避免小膠質細胞過度活化，進而減輕腦損傷。

清達顆粒可有效控制自發(fā)性高血壓大鼠血壓，并減輕其靶器官損害的功效已被證實。褚劍鋒等[6]研究表明，自發(fā)性高血壓大鼠經清達顆粒灌胃3周后血壓已明顯低于對照組，8周后腎小球固縮、心肌纖維腫脹等靶器官損傷均有顯著改善。楊美玲等[16]研究指出清達顆?？山档脱芫o張素Ⅱ(AngⅡ)誘導的高血壓小鼠血壓，并改善其腎臟損傷。除此之外，清達顆粒中單味藥的有效成分如天麻素、黃芩苷、異鉤藤堿等對LPS誘導的細胞炎癥反應及氧化損傷也有一定的抑制功效[7-10]。而蓮子心的有效成分甲基蓮心堿可減輕高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細胞氧化應激損傷[11]。但是目前對清達顆粒本身潛在的抗炎、抗氧化應激功效尚未被廣泛研究。因此，本課題選用BV-2小鼠小膠質細胞系，采用LPS構建細胞炎癥反應模型，觀察清達顆粒對炎癥細胞抗氧化應激的影響。實驗結果表明清達顆?？梢燥@著抑制活化的小膠質細胞釋放如ROS、TNF-α及MDA等細胞毒性物質，并一定程度促進抗氧化酶如GSH-Px的產生及釋放，起到了抗氧化應激的作用。

中草藥作為抗氧化劑清除自由基對抗氧化應激及炎癥損傷的報道屢見不鮮，不僅如此，部分中草藥的有效成分可通過激活抗氧化信號通路，生成內源性抗氧化酶以抑制氧化應激損傷。其中p38MAPK/Nrf2/HO-1信號傳導通路被證實與腦等重要器官的抗氧化應激損傷有關，該通路的激活減輕了氧化應激帶來的損傷，進而保護了腦等重要臟器[17]。在氧化應激時，產生的ROS經由p38MAPK信號通路使穩(wěn)定狀態(tài)下的轉錄因子Nrf2磷酸化，解除與keap-1的結合而轉位至細胞核，在細胞核與一種重組蛋白形成異二聚體并同抗氧化元件相結合，從而啟動HO-1基因的轉錄。HO-1是經典的內源性抗氧化酶，具有良好的抑制氧化應激及炎癥的作用，而該信號通路除了具有保護重要臟器的作用外，還對神經系統(tǒng)有保護作用[5]。該通路是否是清達顆粒抗氧化作用可能的干預通路目前尚未被研究證實。本實驗研究發(fā)現(xiàn)清達顆?？纱偈够罨腂V-2細胞內 p38 蛋白磷酸化，轉位進入細胞核的Nrf2增多，并產生更多的 HO-1。除此之外，運用 p38MAPK 激酶抑制劑(LY2228820)進行干預后HO-1蛋白的表達量明顯減少。本實驗結果表明清達顆?？赡芡ㄟ^ p38MAPK/Nrf2/HO-1信號轉導通路起到一定程度的抗氧化應激作用。此外，清達顆粒還可能作用于其他 MAPK 信號通路或其他抗氧化信號通路和靶點，進而誘導HO-1基因表達。

目前清達顆粒對腦細胞氧化應激調控是否存在其他作用靶點或信號通路仍值得繼續(xù)研究，本實驗為進一步闡明清達顆粒對腦細胞氧化應激的調控機制以及清達顆粒對高血壓靶器官保護提供了一定的實驗依據。