李 樊，付士紅，何小周，何亞明，葉 盛，邵 楠，殷啟凱，趙潔榮，馮盼盼，祿 陽(yáng)，陳曉菁，何 英，凌 華，馬學(xué)軍，梁國(guó)棟，許松濤，王環(huán)宇

重慶市位于中國(guó)內(nèi)陸西南部、長(zhǎng)江上游地區(qū)，長(zhǎng)江橫貫其全境。面積8.24萬(wàn)km2，轄38個(gè)區(qū)縣(26區(qū)、8縣、4自治縣)。地貌以丘陵、山地為主，有“山城”之稱。重慶屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤(rùn)氣候，氣候溫暖濕潤(rùn)、適宜媒介昆蟲(chóng)孳生繁殖。 因氣候、環(huán)境、地理?xiàng)l件等原因，重慶市一直以來(lái)是乙型腦炎的高發(fā)地區(qū)，因此在當(dāng)?shù)亻_(kāi)展蟲(chóng)媒調(diào)查，對(duì)于了解當(dāng)?shù)匚孟x(chóng)乙腦病毒帶毒率及分子遺傳特征，了解該地區(qū)蚊蟲(chóng)攜帶病毒的種類及多樣性，以及蟲(chóng)媒病毒病的防控都具有重要意義[1-3]。

Yichang病毒是一種昆蟲(chóng)病毒，屬于套式病毒目(Nidovirales)Mesoniviridae病毒科，最早于2014年中國(guó)湖北省宜昌市采集的蚊蟲(chóng)標(biāo)本中被分離出來(lái)，湖北省多個(gè)地區(qū)的蚊蟲(chóng)標(biāo)本中也曾檢測(cè)到該病毒的核酸[4]。目前，對(duì)于該病毒的宿主范圍、流行地理范圍尚不清晰。本研究對(duì)2017年在重慶市開(kāi)展蟲(chóng)媒病毒調(diào)查的過(guò)程中從庫(kù)蚊標(biāo)本中分離到Y(jié)ichang病毒進(jìn)行報(bào)道。

1 材料和方法

1.1標(biāo)本采集 2017年9月初在重慶市巴南區(qū)和豐都縣的人房和豬圈采用吸入式捕蚊器在晚間5-9點(diǎn)誘捕采集成蚊，當(dāng)日回收成蚊放置-20 ℃冰箱冷凍30 min，剔除雄蚊并按不同種屬對(duì)雌蚊分類，30～50只/管裝至凍存管，編號(hào)后迅速保存于液氮罐中。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為白紋伊蚊細(xì)胞(Aedes albopictus cell，C6/36)、金黃地鼠腎細(xì)胞(BHK-21)、非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)，由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所保存。C6/36細(xì)胞培養(yǎng)液為1640培養(yǎng)基(Gibco)含10%胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS, Gibco)和100 U/mL青霉素和鏈霉素。 BHK-21、Vero細(xì)胞培養(yǎng)液為MEM培養(yǎng)基含10% FBS和100 U/mL青霉素和鏈霉素。

1.3病毒分離 在生物安全柜內(nèi)向每支蚊蟲(chóng)標(biāo)本中，加入1 mL含100 U/mL青霉素和鏈霉素的MEM培養(yǎng)液, 使用組織研磨機(jī)(美國(guó)QIAGEN公司)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行研磨, 將研磨后的標(biāo)本于4 ℃，18 000×g，離心20 min。吸取上清液150 μL用0.22 μmol/L過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾后，接種到已長(zhǎng)成70%～80%的單層C6/36、Vero、BHK-21細(xì)胞，吸附1 h后，加入1 mL含2% FBS的細(xì)胞維持液，分別置于5% CO2培養(yǎng)箱中，逐日觀察細(xì)胞病變(Cytopathic effects，CPE)情況，當(dāng)CPE達(dá)到75%時(shí)收獲培養(yǎng)上清液，再次接種細(xì)胞；以相同程序盲傳3代，有病變的分離物繼續(xù)進(jìn)行鑒定分析。

1.4核酸提取及高通量測(cè)序 取陽(yáng)性分離物上清液，用QIAamp viral RNA mini kit(QIAGEN公司)按說(shuō)明書(shū)提取病毒RNA，采用Superscript III反轉(zhuǎn)錄酶(Thermo Fisher)和隨機(jī)引物合成cDNA，采用NEBNext mRNA Second Strand Synthesis Module(美國(guó)NewEnglandBiolabs公司)完成第2鏈DNA合成。再用Nextera XT DNA Library Preparation Kit (美國(guó)Illumina公司)完成文庫(kù)構(gòu)建。該文庫(kù)在Qubit 4.0熒光計(jì)(Thermo Fisher)定量后，在Illumina iseq平臺(tái)上進(jìn)行雙端測(cè)序(2×150堿基)。 根據(jù)平均質(zhì)量值(Q30)評(píng)價(jià)測(cè)序質(zhì)量并過(guò)濾數(shù)據(jù)。將過(guò)濾后數(shù)據(jù)拼接生成Contig，在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)病毒基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中(http://www.NCBI.nlm.nih.gov)進(jìn)行BLAST比對(duì)。將過(guò)濾后數(shù)據(jù)用useglaxy(https://useglaxy.org/)中的Bowtie 2比對(duì)目標(biāo)基因組，并生成Consensus序列。使用Open Reading Frame Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)預(yù)測(cè)基因組開(kāi)放閱讀框。獲得病毒的全基因序列已提交NCBI基因庫(kù)，登錄號(hào)為MT070763。

1.5系統(tǒng)發(fā)育分析 使用MAFFT V7(https://www.ebi.ac.uk/Tools/)進(jìn)行多序列比對(duì)。利用NCBI BLAST對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行核苷酸與氨基酸序列一致性分析。從GenBank中選取與陽(yáng)性序列相似的參考毒株，用MEGA X構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié) 果

2.1病毒分離 2017年9月，在重慶市巴南區(qū)和豐都縣共采集到732只蚊蟲(chóng)標(biāo)本(圖1)，其中騷擾阿蚊672只(92%)，致倦庫(kù)蚊30只(4%)，三帶喙庫(kù)蚊30只(4%)。這些蚊蟲(chóng)被分為20批次接種細(xì)胞。從重慶地區(qū)豐都縣致倦庫(kù)蚊標(biāo)本分離物在接種C6/36細(xì)胞后72 h開(kāi)始引起細(xì)胞CPE。CPE的主要特征是細(xì)胞變圓、皺縮、甚至脫落(圖2)，120 h后細(xì)胞完全病變。而B(niǎo)HK-21和Vero細(xì)胞在3次盲傳過(guò)程中均未觀察到CPE。該分離物被定名為CQFD2017。

地圖中重慶市所在區(qū)域以淺灰色標(biāo)識(shí)，豐都縣和巴南區(qū)以深灰色標(biāo)識(shí)。圖1 蚊蟲(chóng)標(biāo)本采集地點(diǎn)Fig.1 Locations where mosquito samplings were performed

2.2CQFD2017基因組序列分析 為鑒定所分離的病毒，對(duì)病毒基因組進(jìn)行高通量測(cè)序分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析。 CQFD2017的組裝基因組為20 893 bp，3′端含有poly(A)尾。該基因組鑒定出6個(gè)開(kāi)放閱讀框：ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、 ORF3a、ORF3b。ORF1a跨越核苷酸317-8 635 nt，并編碼2 772個(gè)氨基酸；ORF1b跨越核苷酸8 614-16 413 nt，編碼2 600 個(gè)氨基酸；ORF2a跨越核苷酸16 473-19 181 nt, 編碼902個(gè)氨基酸; ORF2b跨越核苷酸16 436-17 110 nt，編碼224個(gè)氨基酸; ORF3a跨越核苷酸19 224-19 709 nt，編碼161個(gè)氨基酸; ORF3b跨越核苷酸19 534-19 908 nt，編碼124個(gè)氨基酸; 而5′和3′非編碼區(qū)的長(zhǎng)度分別為316 bp和529 bp。拼接組裝獲得contig經(jīng)BLASTx分析表明，它與Mesoniviridae病毒科的Yichang病毒(NC_040534)最為匹配。組裝獲得的CQFD2017全基因組與Yichang病毒的核苷酸一致性有98.6%，ORF1a和ORF1b區(qū)域的氨基酸一致性分別為99.06%和99.15%，CQFD2017與Mesoniviridae病毒科其他成員的的氨基酸一致性在22%～51%之間(表1)。

2.3CQFD2017的系統(tǒng)發(fā)育分析 為了研究CQFD2017的系統(tǒng)進(jìn)化地位，從NCBI 的GenBank下載了與CQFD2017相似性≥30%的RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)氨基酸序列，并用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。分析表明，CQFD2017屬于Mesoniviridae病毒科，為Yichang病毒。CQFD2017與冠狀病毒科的形成了不同的進(jìn)化分支，與Nam Dinh病毒、DaK Nong病毒、Hana病毒等構(gòu)成了Mesoniviridae病毒科進(jìn)化簇(圖3)。

(A)C6/36細(xì)胞對(duì)照;(B)CQFD2017感染細(xì)胞72 h; (C) CQFD2017感染細(xì)胞120 h。比例尺為200 μm圖2 CQFD2017對(duì)C6/36細(xì)胞致病變作用Fig.2 Cytopathic effects (CPEs) caused by CQFD2017 in C6/36 cells

表1 CQFD2017與Mesoniviridae病毒科家族成員的氨基酸序列比對(duì)分析Tab.1 Amino acid identities between CQFD2017 and other members of family Mesoniviridae

注：實(shí)心圓表示CQFD2017分離株；分支節(jié)點(diǎn)上的校驗(yàn)值表示經(jīng)1000次重構(gòu)后相應(yīng)分支出現(xiàn)的概率；隱藏分支節(jié)點(diǎn)上小于60%的校驗(yàn)值。圖3 基于宜昌病毒分離株CQFD2017的RdRp區(qū)氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Neighbor-joining tree inferred from molecular phylogenetic analysis based on the amino acid sequences of CQFD2017 RdRp segments

3 討 論

套式病毒目(Nidovirales)病毒是一類主要感染哺乳動(dòng)物, 少數(shù)感染禽類及無(wú)脊椎動(dòng)物的有囊膜的單股正鏈RNA病毒，也是目前已知的含有最長(zhǎng)基因組的RNA病毒。根據(jù)2016年國(guó)際病毒分類委員會(huì)對(duì)RNA病毒的分類，目前該病毒目包含4個(gè)病毒科：動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、桿狀套病毒科(Roniviridae)及近些年被鑒定出來(lái)的(Mesoniviridae)[5]。 以引起藍(lán)耳病的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)為代表的動(dòng)脈炎病毒科基因組RNA約12.7～15.7 kb，被稱作為“小”基因組套式病毒；冠狀病毒科(包括SARS病毒、MERS病毒等)、桿狀套病毒科的基因組RNA長(zhǎng)約26.3～31.7 kb, 被稱作“大”基因組套式病毒; 新發(fā)現(xiàn)的Mesoniviridae科病毒(Nam Dinh病毒、DaK Nong病毒等)基因組大小位于上述兩者之間，被稱之為 “中等”套式病毒[6-7]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，越來(lái)越多套式病毒目的成員被分離鑒定[4, 8-10]。近年來(lái)，Mesoniviridae病毒科成員被從亞洲(越南、泰國(guó)、韓國(guó)、印度尼西亞和中國(guó))、非洲(科特迪瓦)、大洋洲(澳大利亞)和北美洲(美國(guó))等多地的蚊蟲(chóng)和蝙蝠中分離出來(lái)，表明了這類病毒地理分布的廣泛性[8, 10-16]。

2017年9月，本課題組在重慶市的巴南區(qū)和豐都縣開(kāi)展了蟲(chóng)媒調(diào)查，并從豐都縣采集的庫(kù)蚊標(biāo)本中分離到Y(jié)ichang病毒CQFD2017株。經(jīng)對(duì)其細(xì)胞生物學(xué)水平及分子遺傳學(xué)水平的研究發(fā)現(xiàn)，該病毒與2014年袁志明教授團(tuán)隊(duì)分離自中國(guó)湖北省宜昌市庫(kù)蚊標(biāo)本的Yichang病毒為同種病毒，核苷酸序列高度一致達(dá)到98.6%[4]。

重慶市和宜昌市均位于長(zhǎng)江的干流上，三峽水庫(kù)位于重慶和宜昌之間，含重慶市22個(gè)區(qū)縣市及湖北省4個(gè)縣市。而Yichang病毒在2014年和2017年在三峽地區(qū)的多次被分離或檢測(cè)到，表明該病毒在三峽地區(qū)自然界的蚊蟲(chóng)中已形成穩(wěn)定的流行。但前期研究結(jié)果顯示，該病毒僅能在白紋伊蚊細(xì)胞C6/36上引起CPE，而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞BHK-21和靈長(zhǎng)類細(xì)胞Vero上并未觀察到CPE。 但與Yichang病毒同屬M(fèi)esoniviridae病毒科、分離于2002年越南腦炎患者腦脊液中的Nam Dinh病毒已被懷疑是引起人類腦炎的新型病毒。目前對(duì)于Yichang病毒在蚊蟲(chóng)間的傳播機(jī)制及中間宿主的種類尚不明確，該病毒是否能引起人獸疾病尚有待進(jìn)一步探討?？紤]到該病毒具有引起人獸疾病的潛在風(fēng)險(xiǎn)，未來(lái)有必要在三峽地區(qū)開(kāi)展的蟲(chóng)媒監(jiān)測(cè)中持續(xù)關(guān)注該病毒，跟蹤其流行傳播趨勢(shì)及分子遺傳變異特征。

(感謝重慶市疾病預(yù)防控制中心、巴南區(qū)疾病預(yù)防控制中心、豐都縣疾病預(yù)防控制中心的同志在蚊蟲(chóng)標(biāo)本采集過(guò)程中給予的配合和幫助。)

利益沖突：無(wú)