紀(jì)漢斌，何秋霞，龔石林，王文靜，龍飛燕，楊臣臣，禹文海，黃 芬

戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)屬肝炎病毒科，正肝炎病毒屬，是一種經(jīng)腸道傳播的病毒性肝炎病原體[1-2]。HEV是一種單股正鏈RNA病毒，基因組大小約為7.2 kb，包含3個(gè)開(kāi)放式閱讀框架(Open reading frames，ORFs)[3]。ORF1編碼病毒復(fù)制相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白；ORF2編碼病毒衣殼蛋白；ORF3與ORF2部分重疊，與病毒顆粒的釋放有關(guān)。其5′非翻譯區(qū)(UTR)被7-甲基鳥嘌呤覆蓋，3′ UTR以多聚(A)尾巴結(jié)束[4]。HEV感染是世界范圍內(nèi)肝病發(fā)生的主要原因之一。據(jù)WHO報(bào)道，全球每年約有2 000萬(wàn)人感染HEV，約7萬(wàn)人死亡，其中東南亞地區(qū)HEV感染率和死亡率占全球的60.6%和64.7%[5]。近年來(lái)，我國(guó)戊型肝炎發(fā)病率持續(xù)上升，已成為戊型肝炎的高發(fā)國(guó)家[6]。

由于HEV缺乏有效的培養(yǎng)模型，目前HEV尚無(wú)有效的治療藥物。臨床治療主要采用利巴韋林(ribavirin，RBV)和聚乙二醇干擾素(pegylated interferon alpha，peg-IFN)。RBV在腺苷酸激酶作用下被磷酸化為5′-單磷酸利巴韋林(PRV)。PRV抑制次黃嘌呤磷酸脫氫酶(IMPDH)，從而使宿主細(xì)胞內(nèi)鳥嘌呤核苷酸的水平降低，進(jìn)而發(fā)揮抗病毒作用[7]。此外，長(zhǎng)期大劑量服用RBV極易導(dǎo)致患者產(chǎn)生貧血等副作用[8-10]。IFN-α是治療慢性乙肝和丙肝的常用藥，在天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[11-12]。它能夠通過(guò)激活干擾素誘導(dǎo)基因(interferon-stimulated gene, ISG)表達(dá)，抑制HEV復(fù)制[13-15]。但I(xiàn)FN-α治療會(huì)使患者出現(xiàn)外周血白細(xì)胞和血小板減少等不良反應(yīng)，增加腎臟移植接受者急性排斥反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)[16-17]。目前，RBV和IFN-α聯(lián)合使用在能在一定程度上治療慢性戊型肝炎。然而，對(duì)于大部分患者聯(lián)合用藥的療效有限，治療周期長(zhǎng)，毒性較大，其有效性和安全性仍有待研究[18]。

先天性免疫是機(jī)體防御病毒入侵的第1道防線。病毒入侵機(jī)體后可被細(xì)胞的模式識(shí)別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)識(shí)別，刺激機(jī)體產(chǎn)生干擾素和白介素等物質(zhì)，從而消滅病毒[19-24]。宿主限制因子有潛在的抗病毒活性，例如： Trim5α和APOBEC3G都會(huì)通過(guò)特定的方式在HIV復(fù)制階段阻斷HIV復(fù)制[25-26]。2002年高光俠等人發(fā)現(xiàn)了一種重要的宿主限制因子：鋅指抗病毒蛋白(zinc finger antiviral protein，ZAP)，ZAP參與天然免疫干擾素途徑，是PRRs中的一員，能夠識(shí)別并消除細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的病毒RNA[27-28]。ZAP作為反式作用因子，直接作用于病毒RNA中的ZAP敏感元件(ZAP-responsive element, ZRE)，利用細(xì)胞poly(A)特異性核酸酶(poly(A)-specific ribonuclease，PARN)切除病毒的poly(A)尾，從而利用RNA外切酶加工復(fù)合體exosome降解病毒RNA[27, 29-31]。ZAP還能利用輔因子RNA解螺旋酶p72招募細(xì)胞脫帽復(fù)合體Dcp1/2去除病毒5′帽子結(jié)構(gòu)，從而利用5′外切酶XrnI降解病毒RNA[32]。這表明ZAP在病毒感染的先天防御中發(fā)揮著重要作用。

目前已經(jīng)證實(shí)ZAP能夠抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒、絲狀病毒、嗜肝DNA病毒和披膜病毒的復(fù)制[27, 33-35]，但ZAP與HEV的關(guān)系尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)BALB/c小鼠尾靜脈注射ZAP真核表達(dá)質(zhì)粒，過(guò)表達(dá)ZAP后接種HEV，結(jié)果表明ZAP抑制HEV的復(fù)制，為HEV的預(yù)防與治療提供新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、毒株和質(zhì)粒 基因Ⅳ型HEV(strain KM01，GenBank No.KJ155502)(1×104copies/mL)、18T-ZAP、pcDNA3.1-N1以及pcDNA3.1-ZAP均由昆明理工大學(xué)病毒感染與免疫實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2主要試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、 MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑、DNA marker DL15000 購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；DNA 聚合酶和 dNTP 購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；Trizol購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒和 DNA 膠回收試劑盒購(gòu)自北京莊盟生物技術(shù)有限公司; HEV ORF2抗體購(gòu)自美國(guó)Millipore公司(MAB8003)； ZAP多克隆抗體購(gòu)自美國(guó) Proteintech 公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗小鼠的 IgG購(gòu)自北京天德悅公司。

1.3引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank中ZAP的基因序列(GenBank No.BC025308)，經(jīng)Oligo軟件分析設(shè)計(jì)引物，序列如下，上游5′-CGGATCCG atggcggacccggaggtgtgc，下游5′-CAAGCTTG gtaga-gtttactgagcagttc，擴(kuò)增片段大小約為2 740 bp，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.4RT-PCR擴(kuò)增ZAP片段 以5 μL 的18T-ZAP為模板，RT-PCR擴(kuò)增ZAP基因，PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s；50 ℃ 30 s；72 ℃ 3 min 共35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行片段回收，得到擴(kuò)增的ZAP片段。

1.5真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-ZAP的構(gòu)建 將pcDNA3.1載體和ZAP的RT-PCR 產(chǎn)物分別經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切，膠回收載體和目的基因，以T4 DNA 連接酶16 ℃連接過(guò)夜，反應(yīng)體系如下：pcDNA3.1載體骨架(200 ng/μL) 5 μL，目的片段(100 ng/μL)12 μL，10× T4 DNA Ligase Buffer 2 μL，total 20 μL。利用大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒。質(zhì)粒用BamH I和Hind III雙酶切鑒定,并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-ZAP。pcDNA3.1-ZAP示意圖見(jiàn)圖1。

圖1 pcDNA3.1-ZAP載體圖譜Fig.1 pcDNA-ZAP vector map

1.6ZAP抵抗HEV復(fù)制的體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 將BALB/c小鼠分為6組，共18只，每組3只。對(duì)其中4組(G1、G2、G3和G4)分別尾靜脈注射不同濃度pcDNA3.1-ZAP質(zhì)粒(20 ng、40 ng或60 ng)或pcDNA3.1-N1質(zhì)粒(60 ng)。24 h后，對(duì)以上4組接種200 μL HEV病毒懸液。剩余兩組分別設(shè)置為HEV單純感染組G5(接種200 μL HEV病毒懸液)和正常對(duì)照組G6(Mock)。HEV感染24 h后，對(duì)各組小鼠進(jìn)行安樂(lè)處死，采血并收集肝臟組織。

1.7HEV RNA的提取及RT-qPCR檢測(cè) 取小鼠血清200 μL，利用 Trizol 試劑盒提取細(xì)胞總RNA，按照MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，反應(yīng)體系為：cDNA 2 μL、2× ChamQ SYBR Color qPCR Mix 5 μL及上下游引物各0.2 μL，ddH2O補(bǔ)齊至10 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s；60 ℃ 31 s共40循環(huán)。內(nèi)參基因(GAPDH)用作對(duì)照。目的基因的差異表達(dá)倍數(shù)采取2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.8免疫組化 將保存于4%多聚甲醛中的小鼠肝臟組織進(jìn)行石蠟包埋、切片、脫蠟、脫水、乙醇復(fù)水和Tris-EDTA修復(fù)。3% H2O2室溫孵育10 min；5%脫脂奶封閉30 min；HEV(ORF2一抗1∶200,4 ℃孵育過(guò)夜，鼠HRP二抗，1∶250，37 ℃孵育1 h)。ZAP(ZAP一抗1∶200, 4 ℃孵育過(guò)夜，兔HRP二抗，1∶250，37 ℃孵育1 h)，DAB染色，蘇木精染色8 min，1%鹽酸乙醇分化8 s，0.5%氨水反藍(lán)8 s，脫水，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察。

1.9統(tǒng)計(jì)分析 使用Image-Pro Plus 6.0 (IPP) 軟件進(jìn)行積分光密度分析。采用GraphPad Prism 5.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Student-t檢驗(yàn)分析兩組間的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1ZAP片段的擴(kuò)增 以18T-ZAP為模板進(jìn)行RT-PCR體外擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在2 740 bp左右出現(xiàn)特異性條帶。結(jié)果表明，ZAP目的片段擴(kuò)增成功，見(jiàn)圖2。

M為15000 marker；1為PCR擴(kuò)增ZAP目的片段圖2 RT-PCR擴(kuò)增ZAP目的片段Fig.2 RT-PCR products of ZAP target fragment

2.2真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-ZAP的構(gòu)建及鑒定 將ZAP目的片段進(jìn)行膠回收，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后挑選陽(yáng)性菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果顯示質(zhì)粒提取成功。將真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-ZAP采用BamH I和Hind III雙酶切鑒定，可見(jiàn)2 740 bp的目的片段，與預(yù)期結(jié)果一致，見(jiàn)圖3。

M為15000 marker；1為未酶切pcDNA3.1-ZAP質(zhì)粒；2為空白對(duì)照；3為pcDNA3.1-ZAP質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物圖3 真核表達(dá)質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物的鑒定Fig.3 Identification of pcDNA3.1-ZAP eukaryotic expression vector

2.3ZAP在BALB/c小鼠體內(nèi)成功過(guò)表達(dá) 為了驗(yàn)證BALB/c小鼠注射pcDNA3.1-ZAP質(zhì)粒后體內(nèi)ZAP能否成功過(guò)表達(dá)，通過(guò)免疫組化檢測(cè)小鼠肝臟組織中ZAP的表達(dá)，并進(jìn)行積分光密度分析。結(jié)果表明，與正常對(duì)照組 G6相比，注射pcDNA3.1-ZAP后小鼠肝臟中ZAP表達(dá)升高5.8倍(t=29.47,P=0.001 1<0.05)，表明ZAP過(guò)表達(dá)成功，見(jiàn)圖4和圖5。

圖4 免疫組化檢測(cè)ZAP的變化Fig.4 Detection of ZAP by Immunohistochemical

圖5 積分光密度分析ZAP表達(dá)的變化Fig.5 Change of ZAP expression by Integral Optical Density Analysis

2.4ZAP抑制BALB/c小鼠體內(nèi)HEV復(fù)制 為了探究ZAP對(duì)HEV復(fù)制的影響，我們對(duì)BALB/c小鼠注射pcDNA3.1-ZAP質(zhì)粒，24 h后接種HEV，感染后24 h對(duì)小鼠肝臟進(jìn)行免疫組化檢測(cè)及積分光密度分析。結(jié)果顯示，與HEV單純感染組G5相比，小鼠體內(nèi)過(guò)表達(dá)ZAP后肝臟中HEV陽(yáng)性顆粒數(shù)降低82%(t=23.44,P=0.001 8<0.05)，見(jiàn)圖6和圖7，說(shuō)明ZAP能夠抑制體內(nèi)HEV的復(fù)制。

圖6 免疫組化檢測(cè)HEV的變化Fig.6 Detection of HEV by Immunohistochemical

圖7 積分光密度分析HEV表達(dá)的變化Fig.7 Change of HEV expression by Integral Optical Density Analysis

為進(jìn)一步驗(yàn)證ZAP對(duì)HEV復(fù)制的影響，我們對(duì)BALB/c小鼠分別注射不同濃度的pcDNA3.1-ZAP質(zhì)粒，24 h后接種HEV，感染后24 h對(duì)小鼠血清中HEV進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，與單純注射HEV和注射了pcDNA3.1-N1的小鼠相比，注射pcDNA3.1-ZAP的小鼠能夠抑制HEV在血液中的復(fù)制，見(jiàn)圖8。且隨著ZAP濃度增加，HEV在血液中的拷貝逐漸降低，說(shuō)明ZAP對(duì)HEV的抑制效果與劑量相關(guān)。

圖8 RT-qPCR檢測(cè)HEV的變化Fig.8 Detection of HEV by RT-qPCR

3 討 論

HEV是全球腸道傳播病毒性肝炎的主要病因。本研究證明了ZAP在體內(nèi)具有抗HEV的作用。ZAP最初是作為表達(dá)抗莫洛尼氏鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus，MMLV)復(fù)制蛋白而分離出來(lái)的，包含4種CCCH型鋅指結(jié)構(gòu)，與負(fù)調(diào)控RNA穩(wěn)定性的RNA結(jié)合蛋白功能相似[36-37]。ZAP可能直接與病毒RNA相互作用，影響其穩(wěn)定性。ZAP還可能通過(guò)影響蛋白-蛋白或核酸-蛋白相互作用，進(jìn)而影響病毒復(fù)制。

ZAP的抗病毒活性部分取決于病毒基因組中ZREs的存在，其作為宿主抗病毒因子，可通過(guò)降解病毒mRNA或抑制病毒mRNA的翻譯，從而抑制病毒在細(xì)胞質(zhì)中的積累來(lái)阻止獼猴輪狀病毒和委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒的復(fù)制，并能夠通過(guò)靶向L基因序列抑制埃博拉病毒的復(fù)制活性。但ZAP不具備廣譜抗病毒活性。它不能抑制黃熱病病毒、泡狀口炎病毒和單純皰疹病毒1型。Stefanie 等人的研究表明，ZAP在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用，僅在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制的RNA病毒會(huì)受ZAP影響[34-35]。而本研究結(jié)果表明，HEV作為胞質(zhì)中復(fù)制的RNA病毒，其在小鼠體內(nèi)的復(fù)制能被ZAP顯著抑制。這可能也是通過(guò)抑制HEV的mRNA水平實(shí)現(xiàn)的。

與逆轉(zhuǎn)錄病毒、絲狀病毒、嗜肝DNA病毒和披膜病毒不同的是，HEV很難在體外成功培養(yǎng)，致使抗戊型肝炎病毒藥物的研制受阻。2011年，一種針對(duì)戊型肝炎病毒的重組基因疫苗(p239)在中國(guó)上市[38]。 但p239疫苗是針對(duì)基因1型HEV設(shè)計(jì)，但中國(guó)目前主要以基因4型為主，p239是否能達(dá)到有效的保護(hù)作用，還有待進(jìn)一步的觀察。 目前，尚無(wú)有效治療HEV的藥物。臨床常用的RBV和IFN不適用于器官移植患者，會(huì)導(dǎo)致患者嚴(yán)重貧血和并發(fā)性腎功能損傷。并且RBV對(duì)胎兒有致畸性，且會(huì)導(dǎo)致大量HEV耐藥株(G1634R突變株)產(chǎn)生[8-10, 40-41]。因此，RBV和IFN治療范圍有限，對(duì)慢性肝病及免疫力低下患者的長(zhǎng)期療效和安全性仍有待進(jìn)一步臨床確認(rèn)。

ZAP作為一種天然宿主抗病毒蛋白，不僅易于表達(dá)，且能夠靶向作用于病毒基因組，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平抑制病毒復(fù)制，在天然免疫抗病毒過(guò)程中起到了至關(guān)重要的作用。本研究已證實(shí)ZAP能夠有效抑制HEV在動(dòng)物體內(nèi)的復(fù)制，為今后實(shí)現(xiàn)ZAP有效治療HEV提供了重要的前期基礎(chǔ)。

綜上所述，ZAP在機(jī)體抗HEV感染過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。這表明ZAP可成為抗HEV藥物開(kāi)發(fā)的靶標(biāo)，突出開(kāi)發(fā)靶向作用HEV基因組藥物的重要性。為有效治愈孕婦、免疫缺陷患者及其他脆弱人群提供可能，以及為進(jìn)一步研究宿主與HEV相互作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及為篩選抗HEV新型藥物提供新思路。

利益沖突：無(wú)