韓阿祥，康雨童，豐新倩，謝旦立，關(guān)萬春，樓永良

我國是世界上羊毛進(jìn)口和生產(chǎn)加工大國，每年羊毛進(jìn)口量不斷增長[1]。進(jìn)口入境的原羊毛屬于未經(jīng)加工的產(chǎn)品，其攜帶的病原體具有復(fù)雜性及不可預(yù)測性等特點(diǎn)[2]，有學(xué)者曾在入境羊毛中分離出沙門氏菌[3]、大腸桿菌、綠膿桿菌、化膿性鏈球菌、化膿棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌等[4]。目前國內(nèi)關(guān)于入境羊毛的檢驗(yàn)與檢疫方法主要集中在常規(guī)的微生物分離培養(yǎng)，但環(huán)境中99.8%的微生物不能通過常規(guī)的培養(yǎng)方法獲得[5]，因此微生物的常規(guī)培養(yǎng)無法全面的反映微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性[6]。隨著高通量測序技術(shù)以及生物信息學(xué)分析技術(shù)的快速發(fā)展，使得高通量測序技術(shù)在分析微生物的群落結(jié)構(gòu)方面相對于傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)具有完整、精確、可信等優(yōu)勢[7]。近年來16S rRNA擴(kuò)增子測序廣泛應(yīng)用于水體[8-9]、土壤[10-11]、食品[12]以及腸道微生態(tài)[13-14]的研究。據(jù)了解，通過提取羊毛表面微生物的DNA進(jìn)行高通量測序研究其表面微生物群落結(jié)構(gòu)的方法在國內(nèi)尚屬首次。常規(guī)16S rRNA擴(kuò)增子測序只能檢測微生物群落的相對豐度，不能得到微生物絕對豐度信息。微生物的相對豐度只表征了一個(gè)樣本中微生物類群的相對比例，而近年來，特定環(huán)境樣本中某一類群微生物的絕對定量問題受到越來越多研究學(xué)者的關(guān)注[15]。以往大多數(shù)研究往往用相對豐度來進(jìn)行跨樣本間微生物豐度的比較，當(dāng)樣本間總微生物絕對含量存在差異時(shí)，可能會(huì)得出相反的結(jié)論[15]。所以，通過微生物16S擴(kuò)增子絕對定量測序技術(shù)獲得微生物絕對豐度信息能為反映微生物群落結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化提供更多有價(jià)值的參考信息。因此本研究選用微生物16S擴(kuò)增子絕對定量測序的技術(shù)，基于Illumina 2×250 bp的方法獲得5個(gè)國家進(jìn)口的5批次羊毛表面微生物群落結(jié)構(gòu)特征信息，通過后期的分析比對，以期對于海關(guān)的進(jìn)口羊毛風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測和安全評估提供有效的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1樣本的采集 樣本于2019年4月25日在溫州海關(guān)直接獲取，5批羊毛分別來自美國(USA)，阿根廷(ARG)，德國(GER)，比利時(shí)(BEL)，法國(FRA)。

1.2微生物的收集處理 使用電子天平(Sartorius, Germany)分別稱取羊毛10 g置于1 L無菌燒杯中，加入600 mL無菌PBS(pH=7.2)浸泡12 h(期間攪拌震蕩以使羊毛表面微生物充分分散于PBS中)，將全部浸泡液用15～20 μm孔徑的定性濾紙(杭州特種紙業(yè)有限公司)過濾以去除液體中的大顆粒泥沙等雜質(zhì)，取其中200 mL濾液以9 000 r/min (Eppendorf 5810R，Germany)離心10 min，將沉淀全部收集到5 mL磁珠管(PowerWater DNA Isolation kit提供)。

1.3DNA的提取 樣品微生物DNA的提取采用PowerWater DNA Isolation kit(Qiagen，Germany)試劑盒完成，具體步驟參照試劑盒說明書。使用DS-11超微量分光光度計(jì)(DeNovix，USA)測定所提取DNA的濃度以及純度，符合要求的DNA用于后續(xù)測序。

1.4高通量測序 DNA樣品送往上海天昊生物科技有限公司，使用瓊脂糖凝膠電泳方法檢測基因組DNA完整性，Nanodrop 2000(Thermo Fisher Scientific, USA)檢測基因組DNA質(zhì)量，對于合格的樣本檢測區(qū)域進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增，設(shè)置3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌/真菌基因組DNA Mix作為陽性對照，DNA的擴(kuò)增使用的是16S rRNA基因V3-V4區(qū)的引物，引物序列(5′-3′)：正向引物Illumina adapter sequence 1+ CCTACGGGNGGCWGCAG，反向引物Illumina adapter sequence 2+ GACTACHVGGGTATCTAATCC。瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物是否單一和特異。將同一個(gè)樣本的3個(gè)平行擴(kuò)增產(chǎn)物混合，每個(gè)樣本加入等體積的AgencourtAMpure XP(Beckman Coulter, USA)核酸純化磁珠對產(chǎn)物進(jìn)行純化，使用Qubit3.0(Thermo Fisher Scientific, USA)和Agilent 2100 bioanalyzer(Agilent Technologies, USA)評估測序文庫質(zhì)量，最后采用Illumina平臺，2×250 bp的雙端測序策略對文庫進(jìn)行測序，后續(xù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.5數(shù)據(jù)分析 為了得到高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)，以提高后續(xù)生物信息分析準(zhǔn)確性，對下機(jī)后的原始數(shù)據(jù)過濾去除低質(zhì)量的序列；使用FLASH2軟件將雙末端測序得到的成對序列進(jìn)行拼接，得到merge序列，進(jìn)一步去除merge后低質(zhì)量序列；使用Mothur軟件查找并去除序列中的引物；使用Usearch去除總堿基錯(cuò)誤率大于2的序列以及長度小于100 bp的序列，得到質(zhì)量和可信度較高的優(yōu)化序列(Clean reads)，將相似度大于97%的序列聚為同1個(gè)OTU[16]，同時(shí)使用Denovo模式去除嵌合體序列，最終將產(chǎn)生的OTU代表序列通過與數(shù)據(jù)庫比對, 進(jìn)行物種注釋和 OTU 的物種分類?；贛othur軟件計(jì)算α生物多樣性指數(shù)：Chao 1[17], ACE, Simpson和Shannon[18]指數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1樣品序列統(tǒng)計(jì)和稀釋曲線 對原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控過濾后，此次采集的5個(gè)國家的5批羊毛樣本最終得到1 062 239條序列，平均長度為425.80 bp，共聚類于342條OTU。稀釋性曲線圖中，當(dāng)曲線隨著抽取序列數(shù)的增加而趨于平緩時(shí)，說明樣本的測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU，樣本稀釋性曲線(圖1)顯示5條曲線在后期階段均已經(jīng)達(dá)到平臺期，測序量的增加不會(huì)引起過多OTU數(shù)目的增加[19]。

圖1 5批羊毛的樣本稀釋曲線圖Fig.1 Rarefaction curve of five wool samples

表1 5批羊毛樣本的α-多樣性指數(shù)Tab.1 α-diversity index of five wool samples

2.2微生物多樣性分析 樣本的Alpha多樣性指數(shù)(表1)常常用來反映樣本的物種豐富度以及多樣性，其中Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)是生態(tài)學(xué)中用來估計(jì)物種豐富度的常用指標(biāo)，指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高；Shannon指數(shù)反映多樣性指標(biāo)，其值越大說明群落物種的多樣性越高；Simpson指數(shù)常用來反映物種的優(yōu)勢度；5個(gè)樣本Chao1指數(shù)平均值為220.08，ACE指數(shù)平均值為219.78，Shannon指數(shù)平均值為2.30，Simpson指數(shù)平均值為0.21，其中法國的Shannon指數(shù)明顯低于其他4個(gè)國家且Simpson指數(shù)高于其他4個(gè)國家，說明此次研究采集的樣本中法國的樣本群落結(jié)構(gòu)多樣性相對于其他4個(gè)國家處于較低的水平。

圖2 基于 OTU 數(shù)據(jù)的不同樣本微生物群落的主成分分析Fig.2 Principal component analysis (PCA) of all microbial communities based on OTU data

使用主成分分析(PCA)的方法展示本次采集的5個(gè)樣本微生物群落結(jié)構(gòu)之間的差異。結(jié)果見圖2，由圖可見，除德國和比利時(shí)2個(gè)國家樣本點(diǎn)距離較近，其余3個(gè)樣本距離均相距較遠(yuǎn)，說明本次采集樣本中來自不同國家的羊毛表面的微生物組成有差異，其中PC1貢獻(xiàn)度為49.16%，PC2貢獻(xiàn)度為29.34%。

2.3微生物群落結(jié)構(gòu) 通過與數(shù)據(jù)庫的比對，對OTU進(jìn)行了注釋。在門水平上(圖3)，本次采集5個(gè)樣本共測出的微生物門類按平均豐度大小依次為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、Candidatus_Saccharibacteri、軟壁菌門(Tenericutes)、廣古菌門(Euryarchaeota)、浮霉菌門(Planctomycetes)；其中來自阿根廷、德國和比利時(shí)的羊毛表面微生物以變形菌門為主，占比超50%，厚壁菌門次之；而美國和法國則與另外3個(gè)國家趨勢相反，微生物以厚壁菌門為主，占比超50%，變形菌門次之；在微生物總量絕對豐度層面美國>阿根廷>德國>比利時(shí)>法國。屬水平的微生物組成結(jié)果如圖4所示，本次采集5個(gè)樣本共注釋到122個(gè)屬，其中豐度高于1%的有15個(gè)屬，阿根廷、德國和比利時(shí)3個(gè)國家豐度較高的3個(gè)菌屬分別是不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)；美國豐度前3的菌屬為芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、土壤芽孢桿菌屬(Solibacillus)；法國豐度前3的菌屬是土壤芽孢桿菌屬(Solibacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、解鳥氨酸芽孢桿菌屬(Ornithinibacillus)。種水平(圖5)共注釋到了103個(gè)種，其中包括一些常見的條件性致病菌：魯氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter_lwoffii)、黃褐假單胞菌(Pseudomonas_fulva)、腸沙門菌(Salmonella_enterica)、嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas_maltophilia)。為進(jìn)一步揭示微生物群落結(jié)構(gòu)在OTU水平的分布特征，基于OTU水平繪制了韋恩圖(圖6)，如圖6所示，本次采集樣本中美國、阿根廷、德國、比利時(shí)、法國各個(gè)樣本包含的OTU數(shù)目分別為194、189、263、149、188個(gè)，其中德國的OTU多樣性最高，為263個(gè)；比利時(shí)的OTU多樣性最低，為149個(gè)。5批羊毛所共有的OTU為81個(gè)，美國、阿根廷、德國、法國每個(gè)國家所獨(dú)有的OTU為10、19、47、22個(gè)，比利時(shí)獨(dú)有的OTU為0個(gè)。

圖3 樣本在門水平分類等級上的微生物組成Fig.3 Relative abundance and absolute abundance at phylum level

圖4 樣本在屬水平分類等級上的微生物組成Fig.4 Relative abundance and absolute abundance at genus level

圖5 樣本在種水平分類等級上的微生物組成Fig.5 Relative abundance and absolute abundance at species level

圖6 樣本微生物群落OTU水平分布維恩圖Fig.6 Venn diagram based on OTU of microbial community

3 討 論

入境樣本中攜帶的致病菌對于我國的國境衛(wèi)生以及傳染病預(yù)防和控制造成了巨大的挑戰(zhàn)[20]，本研究利用Illumina Miseq測序平臺分析來自美國、阿根廷、德國、比利時(shí)、法國5個(gè)不同國家的入境羊毛表面微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的特點(diǎn)和差異。本次研究采集的羊毛樣本的數(shù)量以及分布范圍有限，故本次研究的樣本不一定能代表某一國家羊毛中微生物的實(shí)際情況，但是利用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)對于進(jìn)一步了解我國入境的羊毛樣本的微生物以及病原體提供了1種新的檢驗(yàn)檢疫技術(shù)方法和思路，同時(shí)測序還發(fā)現(xiàn)了許多未被分類的微生物(Unassigned),驗(yàn)證了通過高通量測序的方法能夠獲得更加全面的生物學(xué)信息，一些未被認(rèn)識和分類的微生物可以通過測序而體現(xiàn)[21-22]。

本研究中，5個(gè)樣本的稀釋曲線(圖1)隨著抽取序列數(shù)增加均已達(dá)到平臺期，表明測序深度充分，評估OTU的數(shù)量接近實(shí)際情況。5個(gè)批次羊毛樣本微生物群落的α-多樣性如表1，Chao1和ACE的結(jié)果表明德國樣本所含OTU數(shù)目最高，美國樣本所含的OTU數(shù)目僅次于德國，而阿根廷、比利時(shí)、法國3個(gè)國家各自所含的OTU數(shù)目大致相同。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)的結(jié)果表明德國樣本的微生物群落多樣性最高，法國樣本的微生物群落多樣性遠(yuǎn)低于其他4個(gè)國家。結(jié)合以上4個(gè)指數(shù)來看，法國的樣本在OTU數(shù)目與阿根廷和比利時(shí)2個(gè)國家相近的情況下，微生物群落多樣性卻遠(yuǎn)低于另外兩個(gè)國家。

主成分分析(PCA)一般用來反映樣本微生物群落結(jié)構(gòu)的差異，如圖2所示，德國和比利時(shí)2個(gè)樣本在圖中的距離較近，其他3個(gè)國家的樣本則分布的相對較遠(yuǎn)，說明德國和比利時(shí)2個(gè)國家的樣本微生物群落差異較小。有趣的是在德國、法國、比利時(shí)3個(gè)國家的地理位置、氣候等外界環(huán)境因子大體相同的情況下，法國的微生物群落結(jié)構(gòu)卻與德國和比利時(shí)有較明顯的差異，根據(jù)Brajesh K. Singh的報(bào)道[23]，對于牧場的土壤給與不同的處理方法會(huì)影響到牧場的微生物群落結(jié)構(gòu)，因此除去地理位置、氣候等環(huán)境因子，造成法國樣本微生物群落結(jié)構(gòu)與其他4個(gè)國家有較大差異的原因可能跟羊的品種、當(dāng)?shù)氐耐寥阑蛘咭恍┤藶榈牟僮?比如飼料的差異，抗生素的使用[24])有關(guān)。

在微生物群落結(jié)構(gòu)的種屬水平，我們發(fā)現(xiàn)了蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)，這是一種在自然界廣泛分布的革蘭氏陽性細(xì)菌[25],這種菌在生長代謝的過程中形成的蛋白晶體毒素能夠?qū)?00多種害蟲具有毒殺作用[26-27]，因此，常被當(dāng)做生物農(nóng)藥而廣泛使用，此次檢測結(jié)果陽性可能跟當(dāng)?shù)啬翀霾扇⑾x措施時(shí)選擇的農(nóng)藥有關(guān)；同時(shí)我們還檢測到了魯氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterlwoffii)、腸沙門菌(Salmonellaenterica)、嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)等臨床上常見的一些條件致病菌，2000年北京市宣武醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房就曾有過魯氏不動(dòng)桿菌暴發(fā)的相關(guān)報(bào)道[28]，隨著不動(dòng)桿菌屬到種鑒定技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，魯氏不動(dòng)桿菌在臨床上的鑒定以及檢出率也在不斷的攀升[29]，近年來有報(bào)道發(fā)現(xiàn)魯氏不動(dòng)桿菌對于光照的抵抗力較30年前明顯增高，其可以出現(xiàn)在光照消毒后的醫(yī)療器械表面[30]，因此這種菌更應(yīng)該引起一線工作人員(海關(guān)進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫人員、洗毛廠工人和裝卸人員)的重視和防范；嗜麥芽窄食單胞菌以往臨床并不常見，由于近年來一些臨床住院患者使用大量抗生素、免疫抑制劑以及介入性的醫(yī)療操作，使得該菌有機(jī)會(huì)造成感染，其具有先天性以及獲得性的耐藥，因此臨床上處理起來非常困難[31]；檢出的魯氏不動(dòng)桿菌以及嗜麥芽窄食單胞菌等條件性致病菌一般情況下對于一線工作人員(海關(guān)進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫人員、洗毛廠工人和裝卸人員)并不會(huì)致病，但是當(dāng)相關(guān)的工作人員操作不當(dāng)、經(jīng)呼吸道吸入、身體有傷口或者免疫抵抗力下降時(shí)，這些條件性致病菌會(huì)使人患病對人體造成危害；在中國大陸地區(qū)統(tǒng)計(jì)的食物中毒病例中，沙門氏菌引起的食物中毒較為常見，引起了全國各地疾控中心以及實(shí)驗(yàn)室的重視[32-34]，有研究人員曾在入境的羊毛樣本中分離出了沙門氏菌[3],這與我們的測序結(jié)果相符合，也曾有報(bào)道指出兒童沙門氏菌感染的來源更有可能是來自于環(huán)境污染而不單單是食物來源[35]，因此這就需要我們對于入境羊毛的風(fēng)險(xiǎn)重新評估，同時(shí)加強(qiáng)對于入境羊毛的管控以及消毒處理，防止沙門氏菌對于羊毛相關(guān)的從業(yè)人員的身體健康和生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重的危害。

羊毛中病原體含量較多且疫情復(fù)雜，依靠常規(guī)的培養(yǎng)分離等檢驗(yàn)檢疫手段，無法對于羊毛的疫情進(jìn)行全面的掌控。本研究使用的16S rRNA擴(kuò)增子測序的方法可作為出入境檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)一個(gè)備選的檢驗(yàn)方法，與常規(guī)的檢驗(yàn)方法相補(bǔ)充，從而獲得更全面入境樣本病原體信息，同時(shí)提醒相關(guān)機(jī)構(gòu)重視羊毛的熏蒸、消毒等除害化處理，一線從業(yè)人員更應(yīng)該做好自我防護(hù)以切斷傳播途徑。這對于我國的國境衛(wèi)生，相關(guān)行業(yè)的安全生產(chǎn)以及人民的健康安全都是十分重要的。

利益沖突：無