江莉莎，劉 平，鄔亭亭，郭述良

結(jié)核病的傳播在全球范圍內(nèi)愈演愈烈，特別是耐藥結(jié)核菌的出現(xiàn)更加劇了疫情流行。噬菌體在結(jié)核病的診斷和治療上已得到了多方面的應(yīng)用。在結(jié)核病診斷方面，熒光報(bào)告噬菌體(LRP)已逐步應(yīng)用于結(jié)核菌及其耐藥性檢測(cè)[1-3]。但國(guó)內(nèi)研究均以現(xiàn)有的熒光報(bào)告噬菌體為基礎(chǔ)做擴(kuò)展探究，尚無(wú)自行構(gòu)建熒光報(bào)告噬菌體的報(bào)道。現(xiàn)有的熒光報(bào)告噬菌體多以噬菌體TM4、D29、L5、Che12為基礎(chǔ)。其中，利用噬菌體TM4、D29構(gòu)建的熒光報(bào)告噬菌體會(huì)殺死宿主菌，而死菌無(wú)法發(fā)出熒光，導(dǎo)致其敏感度較低；L5、Che12因?yàn)槠淙茉葱允删w的特性，其熒光報(bào)告噬菌體敏感度較高，但仍需104/mL結(jié)核菌才能檢測(cè)到熒光[1,4]。另外上述噬菌體均已注冊(cè)專利，對(duì)后續(xù)研究及專利申請(qǐng)不利。因此，不斷篩選新的能感染結(jié)核分枝桿菌的溶源性噬菌體，并完成基因測(cè)序，仍是噬菌體研究者十分重要的基礎(chǔ)工作，以期構(gòu)建出敏感度更高的熒光報(bào)告噬菌體。

1 材料與方法

1.1菌株 恥垢分枝桿菌(MycobacteriumSmegmatis, MS)mc2155(CMCC 93202)由中國(guó)藥品生物制品檢定所王國(guó)治教授饋贈(zèng)。結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv(CMCC93004)由重慶市肺科醫(yī)院饋贈(zèng)。分枝桿菌臨床株36株由重醫(yī)一院患者痰標(biāo)本中分離得到，利用羅氏藥敏培養(yǎng)基(珠海貝索公司)完成菌種和藥敏鑒定。

1.2噬菌體的分離 取5 g土壤樣本，用10 mL 噬菌體緩沖液浸泡30 min，使噬菌體充分進(jìn)入緩沖液中，4 500 g 離心10 min，小心吸取上清液，0.22 μm濾器過(guò)濾除菌。取1 mL上清液與1 mL恥垢分枝桿菌混合，再加入8 mL 7H9液體培養(yǎng)基(BD，美國(guó)，含10% ADC)，混合均勻，在恒溫振蕩器中(37 ℃，160 r/min)震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，離心收集上清液，并用0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾除菌。將100 μL的過(guò)濾液和1 mL的恥垢分枝桿菌菌液充分混勻后室溫靜置15 min，再加入3 mL 7H9固體培養(yǎng)基(BD，美國(guó))，混勻后平鋪于7H10固體培養(yǎng)基(BD，美國(guó))平板上。倒置培養(yǎng)24 h。收集到典型的噬菌斑后再純化5代。根據(jù)噬菌體分離地點(diǎn)及樣本序列號(hào)，將噬菌體命名為Chy5。

1.3噬菌體電鏡觀察 取20 μL電純化的噬菌體液，滴于銅網(wǎng)上，靜置15 min，用濾紙從側(cè)面吸去多余的液體，再加20 μL 2%磷鎢酸于銅網(wǎng)上，染色10 min，待其自然干燥，并在透射電鏡(Hitachi-7500, 日本)下觀察噬菌體形態(tài)。

1.4噬菌體宿主譜 利用單斑法[5]測(cè)定宿主譜。將稀釋的各宿主菌(各結(jié)核臨床株及標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv)分別制成均勻的菌苔。再在各菌苔上滴加5 μL噬菌體樣液，待其晾干后倒置于 37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果至6周后。(陽(yáng)性：有噬菌斑形成，陰性：無(wú)噬菌斑形成；陽(yáng)性對(duì)照組為恥垢分枝桿菌。)

1.5基因組測(cè)序及生物信息學(xué)分析 用λ噬菌體DNA 提取試劑盒(北京艾根比公司)，按操作說(shuō)明提取噬菌體Chy5的 DNA。噬菌體DNA的全基因組測(cè)序采用鳥(niǎo)槍法由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。得到的序列用Phred/PhraD/Consed軟件包組裝、拼接成若干個(gè)重疊群，各重疊群間的缺口通過(guò)設(shè)計(jì)PCR引物，擴(kuò)增連接，得到完整的全基因組序列。用DNAStar軟件包分析基因組組成成分；用Glimmer3.0、GeneMark軟件對(duì)基因組序列作基因預(yù)測(cè)，所得結(jié)果互相補(bǔ)充。為完成噬菌體的基因組比較，將噬菌體基因與公共數(shù)據(jù)庫(kù)基因作blast m8比對(duì)，e-value <= 1e-5，選取每個(gè)蛋白的最好比對(duì)結(jié)果，將兩兩比對(duì)均是最好的結(jié)果保留，然后用perl語(yǔ)言，生成svg的共線性圖。

1.6噬菌體Chy5溶源菌的分離 參照Vanaja Kumar的實(shí)驗(yàn)方法[1]，用無(wú)菌接種環(huán)蘸取Chy5噬菌斑中幾乎清晰透明的區(qū)域，在一塊新的7H10固體培養(yǎng)基平板上接種劃線，倒置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，直至某塊平板上有菌落長(zhǎng)出，即認(rèn)定為Chy5溶源菌。

1.7紫外線誘導(dǎo)試驗(yàn) 參照Vanaja Kumar的實(shí)驗(yàn)方法[1]，從7H10固體培養(yǎng)基上挑取Chy5溶源菌菌落，置于7H9液體培養(yǎng)基中重懸。取500 μL混懸菌液，在30 W的紫外燈(間距50 cm)下照射30 min，再和500 μL恥垢分枝桿菌菌液及2 mL 7H9固體培養(yǎng)基混合，平鋪于7H10下層平板上冷卻凝固，倒置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。以恥垢分枝桿菌為對(duì)照組重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。

1.8噬菌體超免反應(yīng) 參照Vanaja Kumar的實(shí)驗(yàn)方法[1]，將Chy5溶源菌與7H9固體培養(yǎng)基充分混勻，鋪于7H10下層平板上冷卻凝固，制成菌苔。分別取10 μL 10倍梯度稀釋的Chy5、D29、Leo噬菌體液點(diǎn)涂于菌苔上，并標(biāo)記斑點(diǎn)位置，倒置在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。以恥垢分枝桿菌為對(duì)照組重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1噬菌體分離及噬菌斑形態(tài) 我們以恥垢分枝桿菌為宿主菌，在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院結(jié)核病區(qū)分離得到噬菌體Chy5。噬菌體Chy5在最初24 h形成透明、圓形的噬菌斑，但繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，噬菌斑逐漸變渾濁。

2.2電鏡觀察 噬菌體Chy5由頭部和尾部組成。頭部為對(duì)稱的多面體結(jié)構(gòu)，直徑(61.5±1.4) nm，尾部可彎曲、不可收縮，長(zhǎng)度(114.1±2.1) nm。迄今發(fā)現(xiàn)的分枝桿菌噬菌體均為有尾噬菌體；其中大部分具有可彎曲、不可收縮的長(zhǎng)尾，稱為長(zhǎng)尾噬菌體；小部分僅有不可收縮的短尾，稱為肌尾噬菌體[6]。因此，噬菌體Chy5屬于長(zhǎng)尾噬菌體。

注：白色箭頭指示噬菌體尾部，黑色箭頭指示噬菌體頭部。圖1 噬菌體Chy5電鏡圖(×60 000)Fig.1 Electronmicrogragh of phage Chy5

2.3噬菌體宿主譜 噬菌體Chy5可感染結(jié)核菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv，對(duì)臨床結(jié)核敏感菌感染率可達(dá)100%。除廣泛耐藥菌外，對(duì)耐多藥及多耐藥結(jié)核菌的感染率在85%以上。同時(shí)，噬菌體Chy5還能感染部分牛結(jié)核分枝桿菌及非結(jié)核分枝桿菌，見(jiàn)表1。

2.4 噬菌體基因組測(cè)序及生物信息學(xué)分析

2.4.1基因組組成成分分析 Chy5基因組全長(zhǎng)51 214 bp，G+C含量63.60%，有3種起始密碼子，分別是ATG (n=52), GTG (n=27) 和TTG (n=10)。

表1 噬菌體Chy5宿主譜Tab.1 Host range of phage Chy5

2.4.2基因組功能預(yù)測(cè)分析 經(jīng)軟件預(yù)測(cè)，Chy5有88個(gè)推定基因，大部分與噬菌體D29所對(duì)應(yīng)的基因相似，其中有30個(gè)基因有推測(cè)功能，如表2。按基因功能，主要分為3大類，裂解元件、整合元件以及病毒結(jié)構(gòu)和聚集基因。

噬菌體Chy5的裂解元件由裂解酶A、裂解酶B和Holin蛋白組成，其中ORF 6與D29的裂解酶A相似度99.8%，ORF 7與D29的Holin蛋白相似度100%，ORF 8與D29的裂解酶B相似度99.21%。

噬菌體需將其基因組整合到宿主菌的染色體中，才能產(chǎn)生溶源現(xiàn)象[7]。據(jù)溶源性噬菌體L5的研究表明，attP位點(diǎn)和整合酶在此過(guò)程是必不可少的[7-8]。除此之外，要維持溶源現(xiàn)象的穩(wěn)定，基因組中必須存在有活性的阻遏蛋白[9]。Chy5 ORF 31與D29的整合酶相似度82.58%，推定其編碼整合酶。attP位點(diǎn)通常位于整合酶的下游，且與宿主菌tRNA中的某一段(attB位點(diǎn))重合[10]。因此，利用NCBI的BLASTN功能，對(duì)ORF 31(即整合酶)下游區(qū)域和結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組作比較，發(fā)現(xiàn)一段核酸序列(26973-27013bp)與H37RV基因組中tRNA-Gly基因中某片段(2765541-2765611bp)完全重合，即為attP位點(diǎn)，如圖2。另外，ORF 70推定為編碼阻遏蛋白的基因，但Chy5 ORF 70與噬菌體Pukovnik的阻遏蛋白相似度僅70.82%，是否具有活性，尚待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

病毒結(jié)構(gòu)和聚集基因位于基因組的左臂，共13個(gè)。其中ORF 23編碼卷尺蛋白，與噬菌體尾部長(zhǎng)度相關(guān)[11]。

表2 噬菌體Chy5基因注釋Tab.2 Gene annotation of phage Chy5

402974631569-60768.19ATGDNA polymerase413157731912-11112.11ATG423232232528-687.88ATG433191232322-13615.3ATGHTH_Hin_like443253133238-23526.53ATGRP thymidylate synthase453330633884-19220.33TTG463389635788-63070.04ATGribonucleotidereductase473597736174-657.37GTG483617136356-617.06ATG493704437196-506.06TTG503634037047-23526.41TTG513720037967-25528.55GTGphosphoesterase523796038415-15117.38GTG533841238684-9010.22ATGThioredoxin543868439316-21023.68TTGRP primase/helicase553953039949-13915.93GTGRecombination endonuclease VII563997840121-474.97ATG574011840954-27829.81ATGAbhydrolase/ Esterase_lipase584095141343-13014.58TTG594132841483-515.84GTG604148041716-788.86ATG614187942265-12813.99ATG624229742947-21623.52TTGP-loop_NTPase /RecA-like_NTPases634302743173-485.49GTG644317043769-19922.88GTG654376643906-465.31GTG664390344136-778.7ATG674417744419-809.46ATG684446745276-26930.86GTGRecB-like nuclease694527345692-13915.71ATG704574846242-16419.08ATGrepressor714648946647-525.85GTG724664446916-909.84ATG734714047274-444.93GTGnovel NTPase744691347143-768.76GTG754727447552-9210.19ATG764755248325-25728.94ATG774832848465-455.48ATG784847648679-677.2ATG表2(續(xù))ORFStartStopStrandSize(aa)MW(kDa)Start codonPredicted Function794868948817-425.13GTG804881449080-889.59ATG

814911449476-12013.7ATGParB-like nuclease824950349883-12614.21ATG835000850121-374.13GTG844988050011-435.07GTG855010050294-646.89GTG865030950575-8810.09ATG875057850742-546.21GTG885075051202-15016.94ATG

圖2 噬菌體Chy5基因組的attP位點(diǎn)Fig.2 attP site of phage Chy5 genome

2.4.3共線性分析 與Chy5基因組最相似的噬菌體是D29 和Pukovnik，尤其是D29，如圖3。各基因高度同源，共線性清晰，提示Chy5為A簇噬菌體。

圖3 噬菌體Chy5基因共線性分析Fig.3 Colinearity analysis of the genes of phage Chy5

2.5紫外線誘導(dǎo)試驗(yàn) 將分離得到的Chy5溶源菌在紫外線下照射30 min后，再將其與恥垢分枝桿菌共培養(yǎng)過(guò)夜，平板上可見(jiàn)噬菌斑形成。而以野生型恥垢分枝桿菌為對(duì)照組重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，則沒(méi)有噬菌斑。上述結(jié)果表明Chy5為溶源性噬菌體，可形成溶源菌。

2.6超免反應(yīng) 與對(duì)照組相比，Chy5幾乎無(wú)法在Chy5溶源菌菌苔上形成噬菌斑；D29在高滴度時(shí)可在Chy5溶源菌菌苔上形成噬菌斑，但在低滴度時(shí)亦無(wú)法形成清晰的噬菌斑。而Leo在任何滴度下均可在Chy5溶源菌及恥垢分枝桿菌菌苔上呈現(xiàn)清晰的噬菌斑(圖4)。

注：噬菌體滴度從左到右依次為107、106、105、104 PFU/mL圖4 噬菌體Chy5超免反應(yīng)Fig.4 Superinfection immunity of phage Chy5

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)分離到一株噬菌體，命名為Chy5。其噬菌斑在48 h后變渾濁，提示其可能為溶源性噬菌體。電鏡觀察噬菌體顆粒形態(tài)，見(jiàn)其尾部可彎曲、不可收縮，長(zhǎng)度(114.1±2.1) nm，屬于長(zhǎng)尾噬菌體科。通過(guò)宿主譜測(cè)定，發(fā)現(xiàn)噬菌體Chy5宿主譜廣，不僅能感染結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)株和結(jié)核臨床敏感株，還能感染絕大多數(shù)結(jié)核臨床耐藥株，有望應(yīng)用于熒光報(bào)告噬菌體構(gòu)建，故進(jìn)一步完成基因測(cè)序工作，了解其遺傳信息。

Chy5基因組全長(zhǎng)51 214 bp，G+C含量63.60%，同大多數(shù)A簇噬菌體相同，但低于其宿主菌恥垢分枝桿菌(67.4%) 和結(jié)核分枝桿菌(65.6%)[12]。據(jù)共線性分析結(jié)果，與Chy5基因組最相似的噬菌體是D29，各基因高度同源，提示其為A簇噬菌體。

經(jīng)過(guò)基因功能預(yù)測(cè)分析，證實(shí)Chy5基因組中含有編碼整合酶和阻遏蛋白的基因及attP位點(diǎn)。然而，盡管具有整合酶及attP位點(diǎn)，D29仍然是裂解性噬菌體，這是由于其阻遏蛋白基因上一個(gè)3.5 kb長(zhǎng)的片段的缺失所致[13]。Donnelly-W等證實(shí)，當(dāng)溶源性噬菌體L5的阻遏蛋白部分或全部缺失后，其亦無(wú)法形成溶源菌[9]。因此，具有活性的阻遏蛋白是維持噬菌體溶源性的必備條件。Chy5 ORF 70與噬菌體Pukovnik的阻遏蛋白相似度僅70.82%，尚無(wú)法確定其阻遏蛋白活性。但進(jìn)一步行紫外線誘導(dǎo)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)紫外線照射，可從分離所得的Chy5溶源菌中誘導(dǎo)出噬菌體，證實(shí)Chy5確為溶源性噬菌體。另外，溶源性噬菌體無(wú)法裂解自身溶源菌的現(xiàn)象，稱為超免反應(yīng)；這是由于噬菌體與溶源菌中相同的基因組相互免疫導(dǎo)致的[7,14]。而相似的基因組之間也會(huì)不同程度的發(fā)生這種現(xiàn)象[14]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，噬菌體Chy5幾乎無(wú)法在Chy5溶源菌菌苔上形成噬菌斑，低滴度的噬菌體D29亦無(wú)法在Chy5溶源菌菌苔上形成清晰的噬菌斑，提示發(fā)生超免反應(yīng)。

上述實(shí)驗(yàn)均證實(shí)Chy5為溶源性噬菌體，然而Chy5 ORF 70與Pukovnik的阻遏蛋白存在差異,提示兩者共存某些重要元件使Chy5阻遏蛋白的活性得以保持。有研究表明，L5阻遏蛋白能保持溶源性穩(wěn)定與其含有helix-turn-helix (HTH)DNA 結(jié)構(gòu)域相關(guān)[9,15]。利用NCBI的CD-search功能，搜索噬菌體Chy5和Pukovnik的阻遏蛋白序列中的保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)均存在HTH DNA 結(jié)構(gòu)域，這可能是Chy5 阻遏蛋白能保持活性的原因。

因此，噬菌體Chy5是一株可感染結(jié)核菌的溶源性噬菌體，遺傳背景清楚，有望應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌鑒定及耐藥菌檢測(cè)。

利益沖突：無(wú)