王曉歡，嚴(yán)延生，張智芳，梁小潔，林志龍

中東呼吸綜合征(Middle East Respiratory Syndrome, MERS)首先發(fā)現(xiàn)于2012年6月一名死亡的60歲沙特阿拉伯男性患者[1]。該病的潛伏期為2至14 d，典型表現(xiàn)為急性呼吸道感染，起病急，高熱(39 ℃～40 ℃)，可伴有畏寒、寒戰(zhàn)、咳嗽、胸痛、頭痛、全身肌肉關(guān)節(jié)酸痛、乏力、食欲減退等癥狀。目前尚無(wú)可用的疫苗和特異性治療方法，主要采用對(duì)癥治療和支持性療法。雖然該病最初發(fā)生在中東地區(qū)，但隨著貿(mào)易、旅游、宗教等的活動(dòng)的開(kāi)展，逐漸蔓延到歐洲、非洲、亞洲和北美洲等27個(gè)國(guó)家[2-3]。該病原體宿主主要為單峰駱駝，表現(xiàn)多為有限的人傳人散發(fā)流行方式。

1 病原學(xué)

1.1MERS-CoV的形態(tài)結(jié)構(gòu)與分類學(xué) 冠狀病毒科下分α、β、γ和δ 4個(gè)屬，病原學(xué)調(diào)查確認(rèn)病原體為一種新的冠狀病毒，命名為MERS冠狀病毒(MERS-CoV)。前2個(gè)屬感染人及其他哺乳動(dòng)物等，后2個(gè)屬主要感染禽類等脊椎動(dòng)物。MERS-CoV被分在β冠狀病毒屬，該病毒屬又可進(jìn)一步分為a-d 4個(gè)群，MERS-CoV屬于C群；而引起嚴(yán)重急性呼吸綜合征的冠狀病毒(SARS-CoV)則屬于B群已有報(bào)道冠狀病毒已發(fā)現(xiàn)有60多種(圖1)[4]。冠狀病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)在電鏡下大同小異，多表現(xiàn)為日冕狀或皇冠狀,多為圓形或橢圓形，表面呈突起狀，大的突起主要是刺突蛋白，小的有膜成分在內(nèi)。

圖1 冠狀病毒科α、β、γ和δ 4個(gè)屬及其代表種[4]Fig.1 Four genera and representative species of coronaviridae

1.2 MERS-CoV的分子基礎(chǔ)

1.2.1MERS-CoV的基因組及其功能 MERS-CoV是單股正鏈RNA病毒。全基因組一般超過(guò)30 000個(gè)核苷酸，不同株間略有差別，基因組分析分為A、B兩亞群，但A亞群只有少數(shù)株數(shù)，主要都在B亞群?；蚪M有4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白基因，分別為刺突蛋白基因(Spike，S)、核衣殼蛋白基因(Nucleocapsid，N)、膜蛋白基因(membrane，M)及包膜蛋白基因(envelope，E)，并有7個(gè)開(kāi)放讀碼框(ORF1a、ORF1b、ORF3、ORF4a、ORF4b、ORF5和ORF8b)，前兩個(gè)讀碼框占據(jù)整個(gè)基因組的2/3，主要與病毒的復(fù)制有關(guān)；后5個(gè)讀碼框編碼輔助蛋白，可能與毒株致病力有關(guān)；還有位于基因組兩端的5′、3′非編碼區(qū)(untranslated region，UTR)，MERS-CoV只和同一C群的冠狀病毒基因組有同源性[5-7]。

1.2.2MERS-CoV蛋白的功能 MERS-CoV的4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白S、M、E、N中，以S蛋白最為重要。S蛋白以三聚體形式存在，以機(jī)體的二肽酶(dipeptidyl peptidase-4，DPP4；又稱為CD26)為受體進(jìn)入細(xì)胞，開(kāi)始進(jìn)行病毒的生命循環(huán)。DPP4主要存在于多種哺乳動(dòng)物的腎、小腸、肝和前列腺等臟器的上皮細(xì)胞表面，在單峰駱駝中，DPP4存在于上呼吸道上皮細(xì)胞表面，而在人類中，DPP4則多在肺泡表面表達(dá)。S蛋白在進(jìn)入DPP4前，裂解成S1和S2兩個(gè)亞基，S1與DPP4的受體結(jié)合域(receptor-binding domain，RBD)結(jié)合，此后S2使細(xì)胞與MERS-CoV膜融合，促使病毒核酸進(jìn)入細(xì)胞[7-8]。

S蛋白既存在可使病毒遺傳物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體的RBD，又是進(jìn)入宿主細(xì)胞的主要免疫原，因此是研制藥物的靶點(diǎn)和候選疫苗的主要目標(biāo)蛋白。MERS-CoV能感染多種動(dòng)物，與DPP4能改變與S蛋白結(jié)合介面的靜電荷有關(guān)[8]。

其他3種蛋白M、E、N及輔助蛋白，M主要在病毒的外層，起維護(hù)病毒形態(tài)的作用，與S蛋白相互作用，在E蛋白的輔助下，病毒RNA能進(jìn)入細(xì)胞漿進(jìn)行復(fù)制；E蛋白具有較多的嗜水域，為主在雙脂膜的內(nèi)層，并和N衣殼蛋白相連，在病毒出芽生殖中起作用，N衣殼蛋白最主要的作用在于裹脅、保護(hù)病毒的RNA；輔助蛋白的作用可能與病毒的致病性有關(guān)，現(xiàn)已明確，包括M蛋白在內(nèi)，ORF4a, ORF4b and ORF5編碼的蛋白是1型干擾素的拮抗劑[7-8]。

2 MERS-CoV 流行病學(xué)

2.1流行概況 自2012年6月發(fā)現(xiàn)1例死亡的MERS病例以來(lái)，截至2020年4月底，全球一共報(bào)告了2 519例實(shí)驗(yàn)室確診的MERS病例，其中866例死亡，病死率為34.3%；在確診的病例中，沙特阿拉伯報(bào)告2 121例，約占84.2%，病死788例，病死率為37.1%。在中東以外國(guó)家發(fā)生的疫情較為少見(jiàn)，病患通常有前往中東地區(qū)旅行史。2013年至 2018 年同期比較，報(bào)告病例的人口學(xué)和流行病學(xué)特征無(wú)明顯變化。 50～59 歲年齡組仍然是原發(fā)病例感染的最高風(fēng)險(xiǎn)人群，死亡人數(shù)最多。30～39 歲年齡組人群最容易發(fā)生繼發(fā)病例，繼發(fā)性病例死亡人數(shù)較多的為 70～79 年齡組。自 2015年以來(lái)，由于醫(yī)院感染預(yù)防和控制措施的改善，醫(yī)院獲得性 MERS 病例數(shù)量顯著下降[9-11]。

2.2 傳染源及宿主

2.2.1蝙蝠是MERS-CoV的起源 1965年分離到首株人冠狀病毒[12]，2003年又從SARS患者體內(nèi)分離出SARS-CoV。石正麗團(tuán)隊(duì)2013年從云南昆明的一洞穴菊頭幅中分離的SARS-CoV樣RaTG3毒株與SARS-CoV全基因組符合率高達(dá)96.2%，研究表明該株既能利用果子貍受體ACE2,也能利用人類受體ACE2，說(shuō)明SARS-CoV起源于蝙蝠[4,15]。而MERS-CoV與SARS-CoV同屬于冠狀病毒科β屬，因此MERS-CoV也可能同樣起源于蝙蝠；其次MERS-CoV 屬于β屬C群，這一群包含了多種蝙蝠分離的種株，如BtCoV-HKU4 和BtCoV-HKU5，這也說(shuō)明MERS-CoV與蝙蝠有關(guān)，其起源可能也源于蝙蝠；其三，在2009-2011年對(duì)非洲加納10種蝙蝠4 758只蝙蝠的糞便標(biāo)本進(jìn)行了RT-PCR檢測(cè)，在186只裂顏幅屬種(Nycteris gambiensis)約有46只裂顏幅屬種攜帶有2c β冠狀病毒；歐洲有4種蝙蝠共272份糞便標(biāo)本參與了檢測(cè)，在40份油幅(Pipistrellus)標(biāo)本中檢出2 c β冠狀病毒陽(yáng)性，核苷酸序列分析表明2 c β冠狀病毒符合率與MERS-CoV非常高。但蝙蝠棲息地附近均無(wú)人員或家畜被感染。2011 年9月在南非的Neoromicia cf. zuluensis蝙蝠中分離出非常類似于MERS-CoV的冠狀病毒，2012年10月，在沙特離指標(biāo)病例(index case)很近的1只墓幅屬種( Taphozous perforatus)的糞便顆粒標(biāo)本中用分段RT-PCR擴(kuò)出與MERS-CoV 100%一致的核苷酸序列，并在感染駱駝處的蝙蝠糞便標(biāo)本中也擴(kuò)增出192 bp的MERS-CoV片段，雖然片段短了些，但不是沒(méi)有意義的。因此認(rèn)為蝙蝠是MERS-CoV的儲(chǔ)存宿主[13-17]。

2.2.2單峰駱駝作為傳染性中間宿主的依據(jù) Reusken等在發(fā)現(xiàn)MERS后，對(duì)單峰駱駝、牛、綿羊、山羊和其他駝?lì)惣倚筮M(jìn)行了MERS-CoV特異性抗體的研究，只發(fā)現(xiàn)單峰駱駝?dòng)写祟惪贵w。這意味著單峰駱駝可能是MERS-CoV的中間宿主，但要證明它的傳染性，一是要從單峰駱駝呼吸道中能檢出MERS-CoV；二是血清流行病學(xué)也應(yīng)該在單峰駱駝而不是其他動(dòng)物中找到可抗MERS-CoV感染的中和抗體[18-19]。

2013年10月，在卡塔爾一個(gè)農(nóng)場(chǎng)，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)MERS病例，卡塔爾CDC應(yīng)急小組分別采集了該農(nóng)場(chǎng)的14只單峰駱駝的鼻、肛拭子和血液，用MERS-CoV 的上呼吸道E蛋白基因(upE)、ORF1a、N和S引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，分離病毒并作抗體中和試驗(yàn)分析，用總共4.2 kb的6段擴(kuò)增產(chǎn)物分別與MERS-CoV進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生學(xué)關(guān)系的分析，這些研究證明了單峰駱駝的冠狀病毒與這2病例有關(guān)。同時(shí)，調(diào)查1例沙特阿拉伯病例與其所飼養(yǎng)的9只單峰駱駝的關(guān)系，因?yàn)槠渲?只單峰駱駝在顯示流鼻滴的臨床發(fā)病特征后，這一47歲的男性才發(fā)病，從該病患和其他4只單峰駱駝分離到的病毒存在很高的遺傳符合率。2012年12月1日至2013年12月1日，沙特按人口比例在全國(guó)范圍抽檢了1萬(wàn)多人查MERS-CoV，得出陽(yáng)性率為0.15%，但中和抗體效價(jià)很高；為檢測(cè)環(huán)境暴露的影響，2014年3-11月又抽檢了30個(gè)實(shí)驗(yàn)室的人員及以116人為對(duì)照，在沙特的13個(gè)區(qū)里有8個(gè)區(qū)實(shí)驗(yàn)室人員抗體陽(yáng)性，提示實(shí)驗(yàn)室存在MERS-CoV的環(huán)境污染。由卡塔爾和歐洲一道完成的另一個(gè)研究，也提示少數(shù)與單峰駱駝接觸者曾被MERS-CoV感染過(guò)。前者抽檢了294例與單峰駱駝?dòng)新殬I(yè)接觸的人員，顯示7%的接觸者血液呈MERS-CoV中和抗體陽(yáng)性，而與歐洲合作抽檢的204人的血液顯示陰性結(jié)果。2013年沙特抽檢了303只單峰駱駝，其抗體陽(yáng)性率達(dá)72%；阿曼抽檢了50只單峰駱駝，陽(yáng)性率為100%；阿聯(lián)酋抽檢了500只，其陽(yáng)性率為96%。在非洲，尼日利亞2010-2011年抽檢了4個(gè)省358只單峰駱駝測(cè)抗體，其陽(yáng)性率為94%；突尼斯2009-2013年抽檢了分布于3個(gè)省的204只單峰駱駝，其陽(yáng)性率為48.5%；埃塞俄比亞2011-2013年抽檢了分布于3個(gè)省的188只單峰駱駝，其陽(yáng)性率為96.3%。上述這些檢測(cè)，都證實(shí)了單峰駱駝作為MERS-CoV 的中間宿主和傳染源[20-25]。

2.2.3傳播途徑及易感人群 人感染 MERS-CoV，一般經(jīng)呼吸道吸入被感染的單峰駱駝飛沫，頻繁密切接觸被感染的單峰駱駝或病人[20,26-27]。

Adney團(tuán)隊(duì)(2014)用牛冠狀病毒為抗原，從私人處購(gòu)買了3只成年駱駝(分別編號(hào)為1、2、3，“1”2歲，“2”3歲；“3”5歲，并曾被閹割過(guò))，他們將所試駱駝在接種前2周飼養(yǎng)在動(dòng)物P3實(shí)驗(yàn)室里。用MERS-CoV(HCoV-EMC/2012型菌株)為攻擊毒株，接種之前用50% 空斑試驗(yàn)(TCID50)定量，病毒攻擊總量為107/15 mL；盡量模仿自然感染的模式，設(shè)置了3種傳播途徑和量，這3種途徑分別為氣管(8 mL)、鼻腔(3.3 mL/單側(cè))和眼粘膜(0.2 mL/單只)。接種后1～2 d直至7 d，可檢出感染性的病毒(除“1”于接種后第5 d麻醉處死外)，3號(hào)試駝至28 d仍可檢出病毒RNA；接種攻擊14 d開(kāi)始產(chǎn)生中和抗體，3號(hào)在35 d后中和抗體效價(jià)可達(dá)1∶640；從3只血液、糞便、尿液中均未分離到病毒或檢出病毒RNA，3只駱駝分別于5、28及42 d麻醉處死。臨床癥狀觀察從感染第1 d起即開(kāi)始，一般呈一過(guò)性非典型癥狀，較為明顯的是接種后1～5 d流鼻滴，第2～5 d肛溫有些升高。病理有些變化，尤其是重癥(“1”號(hào))單峰駱駝，在咽后、縱隔、腸系膜和氣管支氣管淋巴結(jié)也檢測(cè)到感染性病毒；“2”在上呼吸道基本未見(jiàn)損傷，在下呼吸道(氣管、支氣管和細(xì)支氣管)的假分層上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)組織學(xué)損傷，但在肺泡中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)組織損傷。3號(hào)在病理上基本未見(jiàn)變化，也檢不出MERS-CoV抗原。這個(gè)研究證實(shí)單峰駱駝存在MERS-CoV重、輕和無(wú)癥狀的感染，人感染與單峰駱駝鼻腔噴出的飛沫和頻繁密切接觸有關(guān)[27]。這種傳播途徑與韓國(guó)2015年的MERS疫情暴發(fā)類似[28]。

3 臨床表現(xiàn)及治療

MERS潛伏期為 2～14 d，通常約為 5～6 d。MERS-CoV感染的臨床表現(xiàn)從無(wú)癥狀或者輕微呼吸道癥狀，到嚴(yán)重急性呼吸道疾病及死亡不等。但多數(shù) MERS-CoV 確診病例都患有嚴(yán)重的急性呼吸道疾病，主要表現(xiàn)為發(fā)燒、咳嗽、呼吸急促。肺炎較為常見(jiàn)，嚴(yán)重時(shí)可引起呼吸和腎衰竭，需要在ICU得到人工通氣和支持。影像學(xué)表現(xiàn)可包括單側(cè)或雙側(cè)肺呈片狀壞死，或呈混濁、間質(zhì)浸潤(rùn)、實(shí)變和胸腔積液。少部分患者并發(fā)有胃腸道癥狀，包括腹瀉和惡心、嘔吐。呼吸道和胃腸道都有感染的癥狀在老年人群、免疫系統(tǒng)功能低下人群和患有癌癥、慢性肺部疾病和糖尿病等慢性病人群中所造成的結(jié)果更為嚴(yán)重[29]。

MERS-CoV引發(fā)的病死率高達(dá)約35%，主要治療方法為支持療法，也采用一些主動(dòng)、被動(dòng)的治療方法，如使用恢復(fù)期血漿、推注免疫球蛋白、單抗和有效的治療其他病的藥物的治療，并且還有最新的抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)療法[30]。

4 實(shí)驗(yàn)室特異性檢測(cè)

WHO于2012年12月制定了MERS-CoV實(shí)驗(yàn)室診斷的臨時(shí)性指南，并于2018年1月進(jìn)行了第 4 次更新[31]。

4.1標(biāo)本采集與運(yùn)送 DPP4 已被證實(shí)為MERS-CoV 的細(xì)胞受體，該受體表達(dá)于人非纖毛支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞，少數(shù)表達(dá)于上呼吸道上皮細(xì)胞，因此，支氣管肺泡灌洗，痰和氣管等下呼吸道標(biāo)本含有較高的病毒載量。WHO的指南要求同時(shí)收集患者上呼吸道和下呼吸道的標(biāo)本檢測(cè)，期間應(yīng)間隔2～3 d采集呼吸道樣本，直到臨床痊愈。

應(yīng)用血清進(jìn)行抗體檢測(cè)時(shí)，確認(rèn)感染需要雙份血清標(biāo)本。血清樣本應(yīng)間隔 3～4 周采集，第1次采集應(yīng)在癥狀開(kāi)始的第1周進(jìn)行。如果只能收集單一血清標(biāo)本，則至少應(yīng)在癥狀出現(xiàn)后 14 d 進(jìn)行。標(biāo)本采集后應(yīng)盡快送到實(shí)驗(yàn)室，但可以在 4 ℃下存儲(chǔ)和運(yùn)輸；當(dāng)有可能超過(guò) 72 h送達(dá)實(shí)驗(yàn)室時(shí)，應(yīng)將標(biāo)本在-20 ℃下儲(chǔ)存且用干冰運(yùn)輸，應(yīng)避免反復(fù)凍融標(biāo)本。

4.2RT-PCR 檢測(cè) 常規(guī)確認(rèn) MERS-CoV 感染一般采用核酸擴(kuò)增方法檢測(cè)，必要時(shí)通過(guò)核酸測(cè)序進(jìn)行確認(rèn)。不推薦將病毒分離培養(yǎng)作為常規(guī)的診斷方法。目前已開(kāi)發(fā)出3種用于MERS-CoV 的 RT-PCR 檢測(cè)試劑，其中包括針對(duì)upE、ORF1b 和ORF1a基因的檢測(cè)。針對(duì)upE檢測(cè)因具有較高的靈敏度被推薦用于篩查，針對(duì)ORF1a的檢測(cè)與針對(duì)upE的檢測(cè)具有相同的靈敏度，而針對(duì)ORF1b的檢測(cè)靈敏度則低于針對(duì)ORF1a 的檢測(cè)。此外，針對(duì) MERS-CoV N蛋白基因的兩種檢測(cè)方法可作為upE和ORF1a的替代性檢測(cè)。這些方法不與其他人冠狀病毒有交叉反應(yīng)。其流程見(jiàn)圖2。

圖2 標(biāo)本的核酸檢測(cè)流程Fig.2 Nucleic acid detection process of specimen

4.3血清學(xué)檢測(cè) 血清學(xué)檢測(cè)適用于按《國(guó)際衛(wèi)生條例》需檢測(cè)，但因條件限制無(wú)法開(kāi)展核酸擴(kuò)增檢測(cè)的人員；應(yīng)用血清學(xué)檢測(cè)也用于確認(rèn) MERS-CoV 感染的病例、持續(xù)性暴發(fā)流行中的部分被調(diào)查人員感染的確認(rèn)。一般血清學(xué)方法使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent，ELISA)和間接免疫熒光試驗(yàn)(indirect fluorescent assay，IFA)，抗體呈4 倍以上增高可以作為確診依據(jù)。

出于生物安全考慮，RT-PCR 檢測(cè)時(shí)，應(yīng)在P2實(shí)驗(yàn)室生物安全柜中加樣，而進(jìn)行病毒分離和中和試驗(yàn)時(shí)，則必須在P3實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行[32]。

5 防 制

已知MERS是一種致死性很高的人獸共患疾病，疫苗靶點(diǎn)為可進(jìn)入細(xì)胞且可產(chǎn)生中和反應(yīng)的S蛋白。但目前研制的疫苗除了小鼠試驗(yàn)有效外，還沒(méi)有一種商業(yè)化人用疫苗研制出來(lái)； 至2016年止，只有DNA疫苗已進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗(yàn)，其他4類(減毒、亞單位及重組載體疫苗等)約12種候選疫苗均處于臨床前研究階段；目前認(rèn)為用改造的MVA病毒載體及黑猩猩腺病毒載體用于MERS疫苗的研制較為合適。有人則認(rèn)為MERS是散發(fā)性傳染病，單峰駱駝是直接或間接的傳染源，只要簡(jiǎn)單的研制獸用疫苗阻斷MERS-CoV的傳播就可達(dá)到防制目的。Haagmans 等[33]用改良的的活病毒疫苗(MVA)載體攜MERS-CoV S蛋白基因經(jīng)粘膜途徑免疫單峰駱駝，發(fā)現(xiàn)該候選苗可以產(chǎn)生抗MERS-CoV的中和抗體，并可減少呼吸道感染性病毒，使所試駱駝癥狀減輕。

在人用疫苗未誕生之前，WHO則建議采用非藥物干預(yù)方式預(yù)防 MERS-CoV的傳播，其中減少動(dòng)物-人的傳播、快速識(shí)別病例、追蹤在醫(yī)療機(jī)構(gòu)與確診病例有關(guān)的所有密切接觸者以及采取控制 MERS-CoV 感染的核心措施。就一般性防護(hù)而言，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)旅游者有針對(duì)性的宣傳教育，前去參觀有單峰駱駝和其它動(dòng)物的農(nóng)場(chǎng)、市場(chǎng)、飼料倉(cāng)或其它可能存在感染性地域的人員應(yīng)當(dāng)采取一般性個(gè)人衛(wèi)生措施，包括盡可能避免與動(dòng)物的接觸，接觸動(dòng)物前后應(yīng)徹底洗手。除此之外，禁食未煮熟的駱駝肉或生駱駝奶[34]。

利益沖突：無(wú)