王超雪，陳瑞戰(zhàn)*，陸娟，田利，殷微，楊汝憑

長春師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院（長春 130032）

黑枸杞（Lycium ruthenicumMurr）為茄科枸杞屬多年生多棘刺灌木，在我國主要分布于青海、寧夏、新疆、甘肅等地[1]；其果實(shí)味甜多汁，營養(yǎng)豐富，被譽(yù)為荒漠中的“軟黃金”和“黑珍珠”，極具研究和開發(fā)價(jià)值[2]。黑枸杞果富含花青素和多糖等多類活性成分[3]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)黑枸杞果具有抗氧化、抗菌、抗衰老、抗腫瘤等多種藥理活性[4-7]。

花青素通常與一個(gè)或多個(gè)單糖通過糖苷鍵連接形成的花色苷，屬于酚類化合物中的類黃酮[8]，是廣泛存在于植物中的天然色素[9]。花青素主要分布在表皮細(xì)胞的液泡內(nèi)，是花和果實(shí)中的主要色素，具有極強(qiáng)的抗氧化活性[10]，能夠清除各種自由基，保護(hù)維生素A不被氧化；能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫活性，提高免疫能力，具有抗過敏、抗菌、抗衰老、抗腫瘤等多種功效[11-12]。肌體新陳代謝過程中會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，正常情況下體內(nèi)抗氧化劑對(duì)自由基的清除與自由基的產(chǎn)生處于動(dòng)態(tài)平衡，但過量積累的自由基會(huì)造成機(jī)體組織及細(xì)胞損害，引發(fā)各種疾病。因此，增加抗氧化劑攝入量，清除自由基對(duì)預(yù)防和治療相關(guān)疾病極為重要，天然花青素作為一類高效的天然抗氧化劑，越來越受到研究者和消費(fèi)者的青睞。

采用不同工藝提取黑枸杞花青素，并進(jìn)行自由基清除活性比較研究，旨在建立一種高效的天然花青素提取工藝。結(jié)果表明，微波提取具有產(chǎn)率高、時(shí)間短、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，適宜于天然花青素的提取。不同提取工藝得到的黑枸杞花青素都具有顯著的抗氧化活性，可作為天然的抗氧化劑用于功能食品和藥品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與試劑

黑枸杞（市售，產(chǎn)自青海省）；花青素標(biāo)準(zhǔn)品（AR，Adamas Reagent Co. Ltd）；DPPH（上海麥克林生化有限公司）；VC（AR，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司）；吩嗪硫酸甲酯（PMS）、還原型輔酶Ⅰ、硝基四氮唑藍(lán)（NBT）（AR，北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SU8000電鏡（日本日立）；SL-2010N超聲裝置（南京順流儀器有限公司）；IKA T10 basic閃式提取裝置（廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司）；MAS-I微波提取儀（上海新儀微波化學(xué)科技有限公司）；MH 2000科偉電子調(diào)溫電熱套；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛郎儀器有限公司）；UV-1601紫外可見分光光度計(jì)（北京北分瑞利分析儀器公司）；Heraeus Multifuge X1R高速離心機(jī)（德國）；Spectra Max Plus 384酶標(biāo)儀（Molecular Devices，美國）。

1.2 黑枸杞花青素的提取

1.2.1 微波提取

準(zhǔn)確稱取5.0 g干燥后的黑枸杞果樣品，加入50 mL的50%酸化（pH 3）乙醇水溶液，室溫浸泡2.5 h，在輻射時(shí)間5 min、功率500 W、溫度40 ℃條件下微波提?。惶崛∫涸? 500 r/min、10 ℃、離心15 min，棄去沉淀，將其上清液減壓濃縮除去乙醇，冷凍干燥得到超聲提取花青素。

1.2.2 超聲提取

準(zhǔn)確稱取5.0 g干燥后的黑枸杞果樣品，加入50 mL的50%酸化（pH 3）乙醇水溶液，室溫浸泡2.5 h，在提取溫度30 ℃、超聲功率210 W、超聲時(shí)間30 min條件下進(jìn)行超聲提?。惶崛∫涸? 500 r/min、10 ℃條件下離心15 min，棄去沉淀，將其上清液減壓濃縮除去乙醇，冷凍干燥得到超聲提取花青素。

1.2.3 閃式提取

準(zhǔn)確稱取5.0 g干燥后的黑枸杞果樣品，分別加入50 mL的50%酸化（pH 3）乙醇水溶液，室溫浸泡2.5 h，在設(shè)定條件下進(jìn)行閃式提取：時(shí)間20 min、轉(zhuǎn)速8 000 r/min、溫度40 ℃；提取液在3 500 r/min、10 ℃條件下離心15 min，棄去沉淀，將其上清液減壓濃縮除去乙醇，冷凍干燥得到閃式提取花青素。

1.2.4 回流法提取

準(zhǔn)確稱取5.0 g干燥后的黑枸杞果樣品，分別加入50 mL的50%酸化（pH 3）乙醇水溶液，室溫浸泡2.5 h，在設(shè)定條件下進(jìn)行回流提?。禾崛r(shí)間2 h，提取溫度100 ℃。不同工藝的提取液在3 500 r/min、10 ℃條件下離心15 min，棄去沉淀，將其上清液減壓濃縮除去乙醇，冷凍干燥得到回流提取花青素。

1.3 花青素提取得率的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.004 g花青素標(biāo)準(zhǔn)品，用50%酸化乙醇（pH 3）定容至10 mL；精確移取0，2，4，6，8和10 mL溶液，用50%酸化乙醇（pH 3）定容至10 mL，靜止10 min，分別移1 mL于比色皿中，在波長530 nm下測(cè)定吸光度，以花青素濃度對(duì)吸光度進(jìn)行回歸，繪制出花青素濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線?；ㄇ嗨靥崛〉寐嗜缡剑?）。

式中：D為花青素提取得率，%；V為試樣定容體積，mL；n為稀釋倍數(shù)，m為試樣質(zhì)量，g。

1.4 抗氧化活性試驗(yàn)

1.4.1 有機(jī)自由基（DPPH·）清除活性測(cè)定

取50 μL不同濃度樣品溶液置于96微孔板中，分別加入20 μL DPPH溶液（0.4 mmol/L），混勻后避光放置30 min，在517 nm波長下測(cè)量吸光度。按照式（2）計(jì)算DPPH·清除活性。

式中：A0為空白對(duì)照試驗(yàn)（水代替花青素溶液）的吸光度；A1為試驗(yàn)樣品的吸光度；A2為無水乙醇代替DPPH·溶液的吸光度。

1.4.2 羥自由基（·OH）清除活性測(cè)定

取50 μL不同濃度樣品溶液置于96微孔板中，分別加入0.1 mL新配制FeSO4溶液（1.5 mmol/L）和0.07 mL H2O2（6 mmol/L），分別加入0.03 mL水楊酸溶液（20 mmol/L）?；靹蚝笾糜?7 ℃水浴中恒溫1 h，在562 nm波長下測(cè)量吸光度。按照式（3）計(jì)算對(duì)·OH清除率。

式中：A0為空白對(duì)照試驗(yàn)（水代替花青素溶液）的吸光度；A1為試驗(yàn)樣品的吸光度；A2為為不加入水楊酸溶液的吸光度。

1.4.3 超氧自由基（·O2-）清除能力測(cè)定

取50 μL不同濃度樣品溶液置于96微孔板中，分別加入0.05 mL NBT溶液（0.15 mmol/L），分別加入0.05 mL還原型輔酶I溶液（0.47 mmol/L）和0.05 mL PMS溶液（0.06 mmol/L）?；靹蚝笾糜?5 ℃水浴中恒溫5 min，在510 nm波長下測(cè)量吸光度。按照式（4）計(jì)算對(duì)·O2-清除率。

式中：A0為空白對(duì)照試驗(yàn)（水代替花青素溶液）的吸光度；A1為試驗(yàn)樣品的吸光度；A2為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）代替NBT溶液的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同提取工藝對(duì)黑枸杞花青素提取得率的影響

微波提取時(shí)間5 min，提取功率500 W，溫度40℃，黑枸杞花青素提取率為5.1%；超聲提取溫度30℃、超聲功率210 W，超聲時(shí)間30 min，提取得率為4.7%；閃式提取時(shí)間20 min，轉(zhuǎn)速8 000 r/min，溫度40 ℃，提取率為3.5%；回流法提取時(shí)間2 h，溫度100℃，提取得率為3.2%；4種提取工藝對(duì)應(yīng)提取得率如圖1所示。結(jié)果表明，不同提取工藝花青素的提取得率不同，微波提取法的提取得率最高，且時(shí)間短，操作簡便，是一種有效的花青素提取方法。超聲提取法花青素的提取得率也相對(duì)較高，分析可能的原因是在超聲波的空化、剪切等作用，強(qiáng)化花青素提取效率。熱回流提取花青素得率最低，可能是由于溫度過高，回流時(shí)間過長，破壞花青素結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致提取得率下降。

圖1 不同提取方法對(duì)花青素提取得率的影響

2.2 對(duì)DPPH·清除活性

自由基清除劑能夠與DPPH的單電子被配對(duì)，在最大吸收波長處顏色變淺，吸光度也會(huì)隨之變小[13-14]。不同提取工藝的樣品對(duì)DPPH·清除能力如圖2所示。結(jié)果表明，4種提取方法得到的花青素都具有顯著的DPPH·清除活性，且清除活性與濃度成正相關(guān)關(guān)系。其中，在0.05～0.25 mg/mL試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，超聲提取產(chǎn)物的DPPH·清除活性最高，清除活性隨濃度增加而快速增加；在0.05～0.25 mg/mL試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)隨濃度增加，4種方法得到的產(chǎn)物其DPPH·清除活性隨濃度增加緩慢增加，閃提產(chǎn)物的DPPH·清除活性相對(duì)較高，但微波、超聲和閃提產(chǎn)物的清除活性沒有明顯的差別；4種提取方法中的回流提取產(chǎn)物的DPPH·清除活性最低，分析可能的原因是常規(guī)的回流提取，溫度較高、回流時(shí)間較長，花青素可能發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，故其DPPH·清除活性相對(duì)較低。說明不同提取方法不僅能夠影響花青素的提取得率，而且能夠影響產(chǎn)物的DPPH·清除活性。

圖2 不同提取方法產(chǎn)物的DPPH·清除活性

2.3 對(duì)·OH清除活性

·OH是一種活性基因，幾乎可以與所有的生物分子、有機(jī)物或無機(jī)物發(fā)生各種不同類型的化學(xué)反應(yīng)，并伴有非常高的反應(yīng)速率常數(shù)和負(fù)電荷的親電性[15]?！H是造成DNA、蛋白質(zhì)、脂膜等生物大分子氧化損傷的主要原因，是公認(rèn)的毒性最大的自由基[16-17]。不同提取方法的黑枸杞花青素對(duì)·OH清除能力如圖3所示。結(jié)果表明，4種提取方法得到的花青素都具有一定的·OH清除活性，且清除活性與濃度成劑量依賴關(guān)系。質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，微波、超聲、閃提和回流提取產(chǎn)物的·OH清除率分別為98.4%，97.4%，90.8%和36.2%，說明微波、超聲和閃提產(chǎn)物都具有較高的·OH清除活性，其中微波提取產(chǎn)物的·OH清除活性相對(duì)較高一些，但與超聲、閃提產(chǎn)物的清除活性差別不大。

圖3 不同提取方法產(chǎn)物的·OH清除活性

2.4 對(duì)·O2-自由基清除活性

圖4 不同提取方法產(chǎn)物的·O2-清除活性

·O2-作為生物體所產(chǎn)生的一種自由基，大量研究證明，自由基的作用與生物衰老、某些疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[18]。具有高的反應(yīng)活性，在化學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物、食品等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。·O2-自身不太活潑，通過歧化反應(yīng)及其它反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基和H2O2，是產(chǎn)生生物體中自由基的根源，所以清除·O2-具有很大意義。不同提取工藝的黑枸杞花青素對(duì)O2-自由基清除能力如圖4所示。在0.1～0.5 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，微波、超聲和閃提提取產(chǎn)物對(duì)·O2-清除率隨濃度的增加快速增加；在質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)微波、超聲和閃提產(chǎn)物對(duì)·O2-清除率分別為：98.5%，98.2%和92.8%，回流提取產(chǎn)物的×O2-清除率僅22.5%。進(jìn)一步說明在較高溫度下和較長的回流時(shí)間作用下，花青素結(jié)構(gòu)變化明顯，其·O2-清除能力大幅降低，說明黑枸杞花青素的提取適宜于較低的溫度下進(jìn)行；在質(zhì)量濃度超過0.5 mg/mL后微波、超聲和閃提產(chǎn)物對(duì)·O-2清除趨于完全，故隨濃度的增加其清除率變化不大。

2.5 不同提取工藝對(duì)植物組織的影響

圖5 不同提取工藝作用后樣品的掃描電鏡圖

為了進(jìn)一步探討不同提取工藝的提取機(jī)理，通過掃描電鏡觀察不同工藝提取后的植物組織；組織破碎越徹底，單位質(zhì)量的固體樣品的比表面積越大，與溶劑接觸的也越充分，花青素的溶解度和擴(kuò)散的傳質(zhì)的動(dòng)力越大，提取得率就會(huì)越高[19]。通過掃描電鏡圖5可以看到，不同提取工藝對(duì)組織細(xì)胞的破壞程度不相同，因而提取得率也明顯不同。圖5（a）是微波提取后黑枸杞果組織細(xì)胞掃描電鏡圖，微波提取過程微波能快速傳遞到組織細(xì)胞內(nèi)部，內(nèi)部的極性分子在微波電磁場中快速轉(zhuǎn)向及定向排列，從而產(chǎn)生撕裂和相互摩擦，使胞內(nèi)溫度迅速升高，使組織細(xì)胞內(nèi)部壓力超過細(xì)胞空間膨脹的能力，導(dǎo)致細(xì)胞破裂，胞內(nèi)花青素快速溶解、擴(kuò)散到周圍溶劑中，提取過程加速、效率大幅提高，因而提取得率最高；圖5（b）是超聲提取后黑枸杞果組織細(xì)胞掃描電鏡圖，在超聲波空化、剪切等作用下，組織細(xì)胞有較大程度破碎，利于花青素的快速溶解、擴(kuò)散，提取效率較傳統(tǒng)的回流提取有較大幅度的提高；圖5（c）是閃式提取后黑枸杞果組織掃描電鏡圖，在均質(zhì)機(jī)的強(qiáng)剪切作用下細(xì)胞組織有所破碎，但組織破碎的程度有限，掃描電鏡圖可以發(fā)現(xiàn)大塊的細(xì)胞組織，其結(jié)果花青素由組織細(xì)胞內(nèi)部向周圍提取溶劑的擴(kuò)散阻力較超聲和微波提取都大，因此提取得率相對(duì)較低；圖5（d）是熱回流提取后組織細(xì)胞的掃描電鏡圖，回流提取是通過加熱使分子運(yùn)動(dòng)加速，使組織細(xì)胞有所破碎，胞內(nèi)有效成分溶出，通過掃描電鏡圖可以發(fā)現(xiàn)，回流對(duì)組織細(xì)胞的影響相對(duì)較小，組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)比較完整，因此提取得率也相對(duì)較低。結(jié)果說明不同提取工藝對(duì)細(xì)胞組織的破碎程度越徹底，強(qiáng)化傳質(zhì)的效率越高，提取得率也越高。

3 結(jié)論

黑枸杞花青素提取工藝對(duì)比中，微波功率500 W、時(shí)間5 min、提取溫度40 ℃時(shí)花青素提取得率最高，方法時(shí)間短，提取率高，操作簡便，是一種高效的綠色提取技術(shù)。不同提取工藝其提取產(chǎn)物的抗氧化活性不同，其中微波、超聲和閃提產(chǎn)物都具有顯著的抗氧化活性，且活性與濃度具有劑量依賴關(guān)系，得到的花青素可以探索作為天然的抗氧化劑應(yīng)用于功能食品和藥品。