程雨龍 楊松林 鄧辰亮 鄭江紅

增生性瘢痕(Hypertrophic Scar，HS)是一種常見(jiàn)的皮膚疾病，通常表現(xiàn)為高出皮膚表面的瘢痕增生，并伴有疼痛、牽拉感或瘙癢[1]。增生性瘢痕的病理生理和分子機(jī)制極為復(fù)雜，目前已發(fā)現(xiàn)的相關(guān)因素包括過(guò)度炎癥、長(zhǎng)時(shí)間再上皮化、細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)沉積等[2]。在皮膚損傷發(fā)生時(shí)，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞以及上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等各種炎性細(xì)胞被招募到損傷部位[3]，隨后釋放多種細(xì)胞因子，如MCP-1、TNF-α、TGF-β、EGF等，刺激一系列瘢痕形成活動(dòng)，如ECM沉積、再上皮化和血管再生等[4-5]。這一過(guò)程涉及多條信號(hào)通路，如通過(guò)激活TGF-β1/Smad信號(hào)通路，可使正常成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致ECM大量沉積[6]。除了TGF-β1/Smad信號(hào)途徑外，一些非Smad途徑也被認(rèn)為可以調(diào)節(jié)HS的形成，例如胞內(nèi)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)途徑。PI3K/Akt細(xì)胞通路被認(rèn)為與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡存在密切關(guān)系。研究表明，PI3K/Akt細(xì)胞通路可以通過(guò)增強(qiáng)IκB的磷酸化，從而激活NF-κB，進(jìn)而促進(jìn)炎癥因子TNF-α的產(chǎn)生和釋放并引起炎癥反應(yīng)[7]。另有研究認(rèn)為，PI3K/Akt在HS中表達(dá)明顯上調(diào)，其抗凋亡作用可能促進(jìn)了成纖維細(xì)胞的增殖[8]。

桃葉珊瑚苷(β-D-吡喃葡萄糖苷，Aucubin)是從日本桃葉珊瑚、杜仲、車前草等植物中分離得到的一種環(huán)烯醚萜苷[9]，具有抗氧化、抗UVA損傷等多種生物學(xué)活性[10]，還具有抗肝損傷、抗炎和促進(jìn)傷口愈合的功效[11]。研究表明，在傷口愈合過(guò)程中，桃葉珊瑚苷可加速再上皮化和ECM形成，并抑制炎癥細(xì)胞的釋放。但目前對(duì)于桃葉珊瑚苷促進(jìn)創(chuàng)面愈合的分子機(jī)制尚不清楚。

在HS的治療方面，壓力療法、皮質(zhì)類固醇、5-氟尿嘧啶(5-FU)和干擾素等已被證明是有效的[12]，但副作用較多，包括色素減退、皮膚和皮下脂肪萎縮、毛細(xì)血管擴(kuò)張等[13]，且復(fù)發(fā)率也較高[14]。本研究擬探究桃葉珊瑚苷對(duì)機(jī)械張力誘導(dǎo)的增生性瘢痕的抑制作用，并對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：4周齡SCID小鼠40只，雌性，體質(zhì)量18～23 g(上海市腫瘤研究所)。桃葉珊瑚苷(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司)。

蘇木精和伊紅染液(Fluka Analytical，瑞士)，Western-blot試劑盒(Promega，美國(guó))，小鼠來(lái)源GAPDH、MCP-1、TNF-α、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt抗體(Sigma，美國(guó))，光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 機(jī)械誘導(dǎo)小鼠HS模型的建立[15]

在小鼠背部切開(kāi)一長(zhǎng)約2 cm切口，6-0尼龍線縫合，4 d后拆除縫線，在傷口兩側(cè)用6-0尼龍線固定張力裝置，每隔一天擴(kuò)張2 mm，并用記號(hào)筆標(biāo)記；8 d后每隔一天擴(kuò)張4 mm，持續(xù)2周，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組小鼠僅切開(kāi)一長(zhǎng)約2 cm切口并縫合，4 d后拆除縫線。

1.3 組織學(xué)檢查

模型建立后1 d， 實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射桃葉珊瑚苷(5 mg/Kg·d)。對(duì)照組小鼠注射等劑量的生理鹽水。2周、4周后切取創(chuàng)面組織。

完整切取標(biāo)本后，10%甲醛固定，石蠟包埋，HE染色后在鏡下觀察，依據(jù)瘢痕指數(shù)、膠原蛋白結(jié)構(gòu)以及炎癥水平進(jìn)行評(píng)分。瘢痕指數(shù)(Scar Elevation Index，SEI)是指瘢痕厚度與鄰近正常皮膚厚度的比值。膠原蛋白的結(jié)構(gòu)和炎癥水平通過(guò)光鏡下檢查染色部分進(jìn)行評(píng)估。

SEI評(píng)分：0分，SEI 0～1；1分，SEI 1～2；2分，SEI 2～3；3分，SEI≥3。

膠原結(jié)構(gòu)：0分，組織良好，無(wú)旋渦樣結(jié)構(gòu)；1分，組織紊亂，無(wú)旋渦樣結(jié)構(gòu)；2分，組織紊亂且有1個(gè)旋渦/高倍視野下(HP)；3分，組織紊亂，≥2個(gè)旋渦/HP。

炎癥水平：0分，無(wú)單核細(xì)胞；1分，單核細(xì)胞或肥大細(xì)胞2～5個(gè)/HP；2分，單核細(xì)胞或肥大細(xì)胞5～10個(gè)/HP；3分，單核細(xì)胞或肥大細(xì)胞>10個(gè)/HP。

最后將每項(xiàng)評(píng)分相加，計(jì)算樣本的組織病理學(xué)得分。

1.4 Western-blot檢測(cè)相關(guān)蛋白

實(shí)驗(yàn)組于注射前、注射后4 周切取創(chuàng)面組織，對(duì)照組在相同時(shí)間點(diǎn)取材。依據(jù)蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取樣本蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，Western-blot檢測(cè)GAPDH(內(nèi)參)、MCP-1、TNF-α、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt在各組標(biāo)本中的蛋白表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 桃葉珊瑚苷對(duì)瘢痕模型組織學(xué)評(píng)分的影響

鏡下觀察兩組標(biāo)本的組織學(xué)和結(jié)構(gòu)變化，并進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分。結(jié)果顯示，2周、4周后取材，相比對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組小鼠瘢痕評(píng)分均明顯降低(P<0.05)(圖1)。

圖1 2周、4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠瘢痕評(píng)分對(duì)比Fig. 1 Comparison of scar scores between the experimental group and the control group 2 weeks and 4 weeks after injection

2.2 桃葉珊瑚苷對(duì)炎癥反應(yīng)的影響

Western-blot結(jié)果顯示，桃葉珊瑚苷注射前，實(shí)驗(yàn)組相比對(duì)照組MCP-1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，表明實(shí)驗(yàn)組中性粒細(xì)胞的趨化因子上調(diào)；注射桃葉珊瑚苷4周后，對(duì)照組MCP-1表達(dá)無(wú)明顯變化，而實(shí)驗(yàn)組中MCP-1表達(dá)顯著降低(P<0.05)(圖2)。

圖2 不同方法處理后MCP-1在各組的表達(dá)對(duì)比Fig. 2 Comparison of MCP-1 expression in each group after different treatments

同樣的，桃葉珊瑚苷注射前，實(shí)驗(yàn)組相比對(duì)照組TNF-α蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；注射桃葉珊瑚苷4周后，對(duì)照組TNF-α表達(dá)無(wú)明顯變化，而實(shí)驗(yàn)組中TNF-α表達(dá)顯著降低(P<0.05)。(圖3)

顯然，桃葉珊瑚苷抑制了TNF-α和MCP-1的蛋白表達(dá)，表明桃葉珊瑚苷可以顯著減輕HS小鼠的炎癥反應(yīng)。

2.3 桃葉珊瑚苷對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響

采用Western-blot檢測(cè)p-PI3K/p-Akt表達(dá)，結(jié)果顯示，桃葉珊瑚苷注射前，實(shí)驗(yàn)組相比對(duì)照組PI3K/Akt磷酸化水平明顯升高(P<0.05)，說(shuō)明HS中PI3K/Akt信號(hào)通路上調(diào)；注射桃葉珊瑚苷4周后，對(duì)照組p-PI3K/p-Akt表達(dá)無(wú)明顯變化，而實(shí)驗(yàn)組表達(dá)顯著降低(P<0.05)，說(shuō)明桃葉珊瑚苷可以顯著降低PI3K/Akt信號(hào)通路的表達(dá)(圖4)。

圖3 不同方法處理后TNF-α在各組的表達(dá)對(duì)比Fig. 3 Comparison of TNF-α expression in each group after different treatments

圖4 不同方法處理后p-PI3K/p-Akt在各組的表達(dá)對(duì)比Fig. 4 Comparison of p-PI3K/p-Akt expression in each group after different treatments

3 討論

增生性瘢痕通常會(huì)發(fā)生在皮膚張力較高的部位，如肩部、頸部和前胸等[16]。研究證明，機(jī)械牽拉可多方面影響成纖維細(xì)胞的生理學(xué)特征，包括遷移、增殖、蛋白質(zhì)合成和基因表達(dá)等[17-18]。隨著皮膚的周期性牽張，HS成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)方向會(huì)與機(jī)械應(yīng)力方向明顯一致[19]。小鼠機(jī)械誘導(dǎo)瘢痕增生動(dòng)物模型是一種特征性很強(qiáng)的模型，且廣泛應(yīng)用于HS的研究[15]。組織病理學(xué)檢查顯示，在機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的HS中，膠原纖維變粗、變大，排列紊亂，形成膠原旋渦。為了消除皮膚張力，早期HS采用壓縮治療的方法[14]，但因舒適性差而導(dǎo)致患者無(wú)法長(zhǎng)期堅(jiān)持[20]。其他方法，包括皮質(zhì)類固醇注射、5-FU注射和激光治療[21]，已被廣泛應(yīng)用于臨床。然而，由于治療副作用多以及復(fù)發(fā)率較高，HS的臨床治療效果仍不令人滿意。

本研究擬將桃葉珊瑚苷作為一種治療HS的潛在藥物進(jìn)行研究。桃葉珊瑚苷是從植物中提取的一種天然化合物，具有多種藥理作用，其抗炎和抗纖維化作用一直被廣泛研究[11]。本實(shí)驗(yàn)中，我們從瘢痕厚度改變、膠原排列以及炎癥反應(yīng)三個(gè)方面評(píng)估桃葉珊瑚苷對(duì)于HS模型的治療效果，發(fā)現(xiàn)其可有效降低HS模型的瘢痕評(píng)分，并以此推測(cè)桃葉珊瑚苷可通過(guò)抑制膠原增生、排列紊亂以及減輕炎癥反應(yīng)而抑制HS形成。

HS的形成可分為3個(gè)階段，即過(guò)度炎癥、長(zhǎng)時(shí)間再上皮化、基質(zhì)沉積[2]。炎癥反應(yīng)是HS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵步驟，可表達(dá)多種細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-6、TGF-β和MCP-1。我們利用Western-blot檢測(cè)炎癥標(biāo)志物TNF-α和MCP-1的表達(dá)，結(jié)果兩者在HS中表達(dá)顯著上調(diào)，但在注射桃葉珊瑚苷后，其表達(dá)水平均明顯降低，恢復(fù)正常。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了桃葉珊瑚苷是通過(guò)抑制HS的炎癥反應(yīng)從而抑制HS的形成。

PI3K/Akt信號(hào)通路在HS的形成中起重要作用，不僅可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，而且在成纖維細(xì)胞增殖中也起重要作用[22]。本實(shí)驗(yàn)探究了桃葉珊瑚苷對(duì)于PI3K/Akt信號(hào)通路的作用，并檢測(cè)桃葉珊瑚苷注射治療后HS小鼠的p-PI3K和p-Akt的表達(dá)。結(jié)果表明，HS小鼠中p-PI3K、p-Akt表達(dá)均有顯著增高，經(jīng)注射桃葉珊瑚苷后，HS小鼠中p-PI3K、p-Akt水平顯著降低，說(shuō)明該信號(hào)通路被桃葉珊瑚苷有效抑制。然而，是否存在其他途徑的參與，以及這些途徑如何影響HS等問(wèn)題仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，桃葉珊瑚苷在動(dòng)物體內(nèi)可通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)而有效抑制增生性瘢痕形成，該作用可能是通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)的。