艾雪峰 朱晶晶 顏冰倩 宮藝其 譚瑤 王會景 徐徐 付煒 莫秀梅 王偉

靜電紡絲技術(shù)已有數(shù)百年歷史，其制備方式簡便易行，制備成本相對低廉，各種有機[1-3]、無機高分子材料[4-5]以及復(fù)合高分子材料[6]均可進行靜電紡絲。如今，靜電紡絲材料已廣泛應(yīng)用于組織工程[7-8]、傳感元器件[9-10]、濾膜[11-12]等多個領(lǐng)域。

通過高壓靜電紡絲技術(shù)獲得的支架材料擁有納米級直徑的纖維、較高的孔隙率和良好的生物相容性，與細胞外基質(zhì)非常相似，常用于組織工程研究中的細胞培養(yǎng)和各種體內(nèi)研究。大量研究表明，通過改變紡絲參數(shù)，如溶液濃度、紡絲速度、電壓、接收器等，可調(diào)整纖維支架的直徑、孔隙率；也可通過添加天然生物材料，如膠原、絲素蛋白，來提高其生物相容性或改變其力學(xué)性能[13]；還可通過添加石墨烯、羥基磷灰石等無機材料以使電紡膜獲得某些特殊的性能。

石墨烯(Graphene，Gr)是21世紀(jì)最具開發(fā)潛力的材料之一[14]，其獨特的二維結(jié)構(gòu)(六邊形蜂巢晶格結(jié)構(gòu))和超薄的厚度(單原子層厚)使其具有優(yōu)異的理化性能，是已知的機械強度最高的材料之一，目前已成為生物醫(yī)學(xué)、能源、材料等各個領(lǐng)域的研究熱點。

本研究在已有的水紡PLCL/Gel納米紗支架材料基礎(chǔ)上，加入1%Gr，探索PLCL/Gel/Gr材料進行水紡的可行性，并對其力學(xué)性能、微觀形貌、生物相容性和皮下移植后細胞浸潤情況進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、PBS緩沖液、青霉素+鏈霉素(Hyclone公司，美國)；胎牛血清(Gibco公司，美國)；CCK-8試劑盒(Dojindo公司，日本)；石墨烯(昂新新型碳材料常州有限公司)；PLCL(濟南岱罡生物科技有限公司)；六氟異丙醇(百靈威科技有限公司)、酶標(biāo)儀(Thermo公司，美國)、掃描電鏡(QUANTA 250，美國)。

1.2 水紡納米紗材料制備

將Gel和PLCL按照質(zhì)量比25∶75混合后溶于六氟異丙醇中，配置成質(zhì)量體積分數(shù)為12%的紡絲液。將紡絲液分為兩組：實驗組加入質(zhì)量體積分數(shù)為1%的Gr，對照組不作處理。將實驗組紡絲液放置在磁力攪拌器上攪拌48 h，再使用超聲波振蕩器進行超聲分散60 min，然后繼續(xù)磁力攪拌24 h；對照組紡絲液放置在磁力攪拌器上攪拌72 h。使用自制動態(tài)液體電紡裝置[15]進行納米紗支架制備，具體靜電紡參數(shù)為：注射泵速度為1 mL/h，針頭到接收平面的高度為15 cm，電壓15 KV，滾筒半徑5 cm，轉(zhuǎn)速60 r/min。所制備的納米紗支架置于-80 ℃冷凍過夜后放入凍干機中凍干，放真空干燥箱中干燥保存。

1.3 結(jié)構(gòu)性能表征

1.3.1體視顯微鏡和掃描電鏡檢測

將充分干燥的材料從真空干燥箱中取出，使用體視顯微鏡觀察兩種支架材料的表面結(jié)構(gòu)，表面噴金后掃描電鏡觀察支架微觀結(jié)構(gòu)和表面形貌，最后利用Image J軟件統(tǒng)計分析支架材料纖維直徑分布，并繪制材料直徑分布圖。

1.3.2力學(xué)性能和吸水性檢測

將材料放入真空干燥箱中1周，充分干燥后，使用英斯特朗拉力機檢測支架材料力學(xué)性能。每組材料5個樣本。繪制并統(tǒng)計材料的應(yīng)力-應(yīng)變曲線、楊氏模量等。將充分干燥的材料裁剪成小塊，干燥稱重結(jié)果記作W1，稱重后浸泡雙蒸水5 min，取出后使用吸水紙將材料表面蒸餾水吸去，再次稱重質(zhì)量記作M2，A表示吸水率，根據(jù)以下公式計算材料的吸水性能。

A=(M2-M1)/M1×100%

1.4 細胞增殖實驗

將兩組支架材料分別裁剪成24孔板大小，75%乙醇浸泡30 min，PBS漂洗5～6次，以5×104個/孔的密度接種3T3細胞。在培養(yǎng)第1、4、7天使用CCK-8試劑盒進行檢測，酶標(biāo)儀檢測反應(yīng)液在450 nm處的吸光度，每組設(shè)4個復(fù)孔。將培養(yǎng)第7天的材料取出，固定包埋后行HE染色。

1.5 支架材料皮下移植及組織學(xué)染色

將支架材料裁剪成直徑8 mm大小的圓片，紫外線照射殺菌，每面照射30 min。使用1%異氟烷麻醉大鼠，將兩組支架分別移植至大鼠皮下兩側(cè)(n=3)，分別于4 d和7 d后取材，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，HE染色，觀察分析材料的細胞浸潤情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PLCL/Gel/Gr材料的制備及表面形貌觀察

經(jīng)過磁力攪拌混勻后獲得兩種不同紡絲液，對照組呈現(xiàn)無色透明狀液體；實驗組因添加石墨烯而呈深黑色，石墨烯均勻分散在溶液中，無明顯塊狀沉淀出現(xiàn)，整體顏色均勻一致。水紡獲得的納米紗支架干燥后大體觀察顯示，對照組為白色疏松狀，實驗組呈均勻一致的黑色，提示石墨烯在材料中均勻分散(圖1)。

A：自制納米紗靜電紡絲裝置；B：左邊白色為未加石墨烯紡絲溶液，右邊為加石墨烯紡絲溶液；C：PLCL/Gel納米紗；D：Gr/PLCL/Gel納米紗 A: Self-made electrostatic spinning device; B: The white on the left is spinning solution without graphene, and the right is spinning solution with graphene; C: PLCL/Gel nanoyarn; D: Gr/PLCL/Gel nanoyarn圖1 納米紗支架材料的制備Fig. 1 Preparation of nanoyarn scaffold material

體視顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，兩組材料整體都呈現(xiàn)疏松的結(jié)構(gòu)形態(tài)，表面不平坦，纖維束間存在溝壑狀間隙，纖維束分布具有一定的方向性；實驗組支架材料可見Gr顆粒均勻分布在支架中(圖2)。

掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，兩組材料的纖維束都呈平行排列，均未出現(xiàn)串珠樣纖維，每一根纖維束由多根納米纖維構(gòu)成，表面相對光滑，對照組纖維束平均直徑(0.988±0.045)μm，實驗組纖維束平均直徑(1.157±0.089)μm，表明加入Gr后纖維變粗，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

2.2 機械性能

根據(jù)拉伸試驗數(shù)據(jù)繪制的應(yīng)力-應(yīng)變曲線顯示，兩組材料拉伸長度和吸水性能沒有明顯差異(P>0.05)，但實驗組的楊氏模量和斷裂點強度都顯著高于對照組(P<0.05)(圖3)。

2.3 體外生物相容性

各組吸光度值均隨培養(yǎng)時間延長而呈增加趨勢，第1、4、7天實驗組吸光度值均高于對照組和空白對照組(P<0.05)，對照組吸光度值高于空白對照組(P<0.05)。HE染色顯示，培養(yǎng)至第7天，細胞已經(jīng)從材料表面慢慢往材料內(nèi)部爬行生長，材料具有良好的生物相容性(圖4)。

2.4 皮下細胞浸潤實驗

體內(nèi)培養(yǎng)4 d，兩種材料均已完全被宿主細胞浸潤，浸潤細胞主要以炎癥細胞為主，對照組炎癥細胞浸潤明顯多于實驗組；體內(nèi)培養(yǎng)7 d，浸潤細胞進一步增多，對照組炎癥細胞浸潤依然多于實驗組(圖5)。

A、B：分別為PLCL/Gel和Gr/PLCL/Gel納米紗支架體視顯微鏡觀察(標(biāo)尺=200 μm)；C、D：分別為PLCL/Gel和Gr/PLCL/Gel納米紗支架掃描電鏡觀察(標(biāo)尺=40 μm)；E、F：分別為PLCL/Gel和Gr/PLCL/Gel納米紗支架纖維直徑分布圖 A, B: Stereo microscope observation of PLCL/Gel and Gr/PLCL/Gel nanoyarn scaffold (Scale bars=200 μm); C, D: Scanning electron microscopy results of PLCL/Gel and Gr/PLCL/Gel nanoyarn scaffold (Scale bars=40 μm); E, F: Fiber diameter distribution statistics of PLCL/Gel and Gr/PLCL/Gel nanoyarn scaffold圖2 納米紗支架材料的表征Fig. 2 Characterization of nanoyarn scaffold materials

A：納米紗支架應(yīng)力-應(yīng)變曲線；B～D：納米紗支架的斷裂強度、拉伸量和楊氏模量比較；E：納米紗支架的吸水性能比較 A: Stress-strain curve of nanoyarn scaffolds; B-D: Comparison of fracture strength, tensile strength and Young's modulus of nanoyarn scaffolds; E: Comparison of water absorption performance of nanoyarn scaffolds圖3 納米紗支架材料力學(xué)性能及吸水性能檢測Fig. 3 Testing of mechanical properties and water absorption properties of nanoyarn scaffold materials

A：接種3T3細胞后第1、4、7天細胞增殖情況；B、C：PLCL/Gel組培養(yǎng)第7天HE染色；D、E：Gr/PLCL/Gel組培養(yǎng)第7天HE染色 A: Cell proliferation on days 1, 4, and 7 after inoculation of 3T3 cells; B, C: HE staining of PLCL/Gel group on the 7th day of culture; D-E: HE staining of Gr/PLCL/Gel group on the 7th day of culture圖4 納米紗支架材料的細胞增殖實驗Fig. 4 Cell proliferation experiments of nanoyarn scaffold materials

A、B：PLCL/Gel組皮下移植4 d；C、D：Gr/PLCL/Gel組皮下移植4 d；E、F：PLCL/Gel組皮下移植7 d；G、H：Gr/PLCL/Gel組皮下移植7 d A, B: PLCL/Gel group after subcutaneous transplantation for 4 days C, D: Gr/PLCL/Gel group after subcutaneous transplantation for 4 days E, F: PLCL/Gel group after subcutaneous transplantation for 7 days G, H: Gr/PLCL/Gel group after subcutaneous transplantation for 7 days圖5 納米紗支架材料皮下移植4 d和7 d后組織學(xué)觀察(HE染色)Fig. 5 HE staining of nanoyarn scaffold materials after subcutaneous transplantation for 4 days and 7 days

3 討論

靜電紡絲技術(shù)制備的支架材料是組織工程材料的重要來源之一。但靜電紡絲材料多由納米級纖維的堆積形成，使得材料過于致密，材料孔徑偏小，移植體內(nèi)后細胞難以穿過并浸潤支架材料。另外，由于致密多孔和材料多為開放環(huán)境制備等多種原因，使得靜電紡絲支架材料易發(fā)生污染，移植后易出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。本實驗利用石墨烯良好的抗炎抗菌特性[16]，加入石墨烯改良水紡方法獲得的靜電紡絲納米紗支架。

掃描電鏡觀察顯示，水紡方法獲得的靜電紡絲納米紗支架是由數(shù)根粗細約1 μm的纖維互相纏繞形成的纖維束組成，并呈現(xiàn)出一定的取向性，這種取向性的形成與傳統(tǒng)靜電紡支架不同，納米紗支架的取向性主要由紡絲液在靜電作用下拉伸成絲狀落入水面后，再由水面中間的旋渦形成相互纏繞的纖維束，通過水面下方旋轉(zhuǎn)的滾筒接收，獲得取向性支架材料。理論上滾筒的接收速度對材料的取向性無明顯影響。但如果單純使用滾筒接收來獲得取向性支架，滾筒的旋轉(zhuǎn)速度必須達到3 000 r/min[17]。通過水紡的方法制備取向性支架可明顯降低轉(zhuǎn)筒的旋轉(zhuǎn)速度，更節(jié)能和安全。我們發(fā)現(xiàn)，加入石墨烯后同樣可以制備出具有取向性的支架，并且未出現(xiàn)串珠樣纖維，證明含石墨烯紡絲液可通過靜電紡絲設(shè)備獲得合適的納米紗支架材料。HE染色發(fā)現(xiàn)，石墨烯均勻分散于材料中。拉伸試驗的應(yīng)力-應(yīng)變曲線顯示，PLCL/Gel納米紗支架具有良好的力學(xué)性能，加入石墨烯后，楊氏模量明顯提高。納米紗結(jié)構(gòu)疏松，無論有無石墨烯，支架親水性都極強，接觸材料表面的水滴能立即被材料浸潤吸收，以至于親水角儀器都無法捕捉到確切數(shù)據(jù)。雖然本研究中含石墨烯PLCL/Gel納米紗支架的親水性優(yōu)于PLCL/Gel納米紗支架，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.806)。正是這種大孔隙的疏松結(jié)構(gòu)更利于細胞的浸潤生長。細胞增殖實驗結(jié)果顯示，兩組支架材料均具有良好的生物相容性和極低的細胞毒性，這與體內(nèi)實驗的組織學(xué)染色結(jié)果一致；體內(nèi)實驗結(jié)果還表明，含石墨烯支架材料具有明顯的抗炎作用，這可能與石墨烯具有良好的抗菌消炎作用有關(guān)。

綜上所述，應(yīng)用石墨烯改良PLCL/Gel納米紗支架材料，可獲得具有合適力學(xué)性能、親水性、生物相容性的納米紗支架材料，在組織工程皮膚等方面具有應(yīng)用潛能。