王健 周栩

小耳畸形是常見的先天性體表畸形，嚴(yán)重影響患者身心健康，耳郭再造是目前最有效的治療手段，其關(guān)鍵是耳郭軟骨支架的制備。目前，常采用自體肋軟骨制備耳郭支架。組織工程的發(fā)展為耳郭再造提供了新的途徑。脂肪干細(xì)胞(Adipose tissue derived stromal/stem cells，ADSCs)是從脂肪組織中分離提取的具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs具有成軟骨分化并形成軟骨樣組織的能力[1-3]。與BMSCs 相比，ADSCs具有來源廣、易獲得、創(chuàng)傷小、純化率高、體外增殖速度快等優(yōu)點(diǎn)，是構(gòu)建組織工程軟骨的理想種子細(xì)胞。

現(xiàn)有證據(jù)表明，不同的脂肪收獲方法可能影響脂肪組織中ADSCs的質(zhì)量和再生潛力[4]。超聲輔助吸脂(Ultrasound-assisted liposuction，UAL)已在臨床廣泛應(yīng)用，其基本原理是將電能轉(zhuǎn)化為振動(dòng)，引起熱效應(yīng)、空泡效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)，從而導(dǎo)致脂肪碎裂[5-7]。但目前尚不清楚超聲輔助吸脂所獲取的hADSCs對構(gòu)建組織工程軟骨是否存在不利因素，因此本研究通過第三代超聲輔助吸脂獲取hADSCs，并與殘耳軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察其在體內(nèi)構(gòu)建組織工程軟骨的效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑與儀器

6周齡雌性裸鼠6只(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)。

PLA、油紅O工作液、茜素紅(Sigma，美國)；Ⅰ型膠原酶(Invitrogen，美國)；10%FBS(Gibco，美國)；完全成脂培養(yǎng)基A、完全成脂培養(yǎng)基B、完全軟骨分化培養(yǎng)基、完全成骨分化培養(yǎng)基(Cyagen，美國)；組織糖胺多糖總含量阿利辛藍(lán)比色法定量檢測試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)。

培養(yǎng)箱(Thermo，美國)；生物力學(xué)分析儀(Instron 5967，美國)。

1.2 人耳軟骨細(xì)胞的獲取和培養(yǎng)

來源于小耳畸形患者術(shù)中廢棄的殘耳軟骨，均獲患者知情同意。取術(shù)中廢棄的殘耳軟骨組織，去除軟骨膜及周圍組織，將殘耳軟骨塊剪成1 mm3碎塊，加入0.15%膠原酶，37 ℃搖床消化10～12 h，200目濾網(wǎng)過濾，2 000 r/min離心8 min，去上清后加入完全培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)后以1×104cells/cm2的細(xì)胞濃度接種于培養(yǎng)皿中，37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每3天換液一次，待軟骨細(xì)胞生長至75%～80%融合時(shí)傳代[8-9]，收集第2代細(xì)胞備用。

1.3 ADSC的分離、培養(yǎng)

脂肪移植物采集自10名要求進(jìn)行吸脂塑形的健康女性志愿者。實(shí)驗(yàn)通過北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審批，所有志愿者術(shù)前均簽署知情同意書。抽脂部位選取同一患者的雙側(cè)大腿，左側(cè)大腿使用第三代超聲輔助抽脂，右側(cè)大腿使用常規(guī)負(fù)壓抽脂。局部腫脹麻醉后，第三代超聲輔助抽脂技術(shù)采用3.7 mm、3環(huán)探頭在50%功率下連續(xù)模式乳化脂肪，當(dāng)幾乎感覺不到阻力時(shí)停止乳化。常規(guī)負(fù)壓抽脂采用3.7 mm長吸脂管進(jìn)行常規(guī)負(fù)壓脂肪抽吸(-0.5 bar)。獲取脂肪組織后，剝除肉眼可見的筋膜、小血管等脂肪周圍組織，剪成1 mm3大小組織塊，加入終濃度為 0.075%的Ⅰ型膠原酶，37 ℃搖床內(nèi)消化40 min，加入含10%FBS的低糖 DMEM 培養(yǎng)基終止消化，200目濾網(wǎng)過濾，1 500 r/min離心5 min，去上清后加入完全培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)后以5×104cell/cm2的細(xì)胞濃度接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每3天換液一次，待細(xì)胞融合達(dá)85%后傳代，收集第3代細(xì)胞備用。

1.4 hADSCs誘導(dǎo)分化及檢測

1.4.1成脂分化誘導(dǎo)

37 ℃的6孔板中加入第3代hADSCs，37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，直到細(xì)胞達(dá)到100%融合。將原培養(yǎng)基替換為2 mL完全成脂培養(yǎng)基A培養(yǎng)3 d，然后替換為完全成脂培養(yǎng)基B培養(yǎng) 24 h。培養(yǎng)基A和B重復(fù)交替3個(gè)周期。用10%中性甲醛固定30 min，1 mL油紅O工作液染色10 min，顯微鏡下觀察細(xì)胞。

1.4.2成骨分化誘導(dǎo)

取第3代hADSCs，37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，直到細(xì)胞融合達(dá) 80%～90%，替換為2 mL完全成骨分化培養(yǎng)基，每3天更換1次培養(yǎng)基。3 周后用10%中性甲醛固定30 min，1 mL茜素紅染色5 min，顯微鏡下觀察細(xì)胞。

1.4.3成軟骨分化誘導(dǎo)

取第3代hADSCs接種于離心管中，加入完全軟骨分化培養(yǎng)基，平均每管細(xì)胞數(shù)為2×105個(gè)。每3天更換1次培養(yǎng)基。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周后，固定細(xì)胞，石蠟切片，阿爾新藍(lán)50～60 ℃染色15 min，顯微鏡下觀察細(xì)胞。

1.5 材料支架的制作

取無紡PGA，均勻嵌入預(yù)制的圓柱狀(直徑5 mm、厚度1 mm)模具內(nèi)，滴加含0.5%PLA的二氯甲烷溶液約50 μL，待其自然干燥后，用75%乙醇浸泡8 h，PBS洗滌3次，含10%FBS低糖DMEM培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)過夜，準(zhǔn)備接種細(xì)胞。共制作支架36個(gè)。

1.6 細(xì)胞-支架復(fù)合物的體外培養(yǎng)及分組

實(shí)驗(yàn)分為3組，每組12個(gè)細(xì)胞-支架復(fù)合物。對照組1(MC)，接種單純殘耳軟骨細(xì)胞，細(xì)胞濃度為 5.0×107cells/mL。對照組2(Co-culture 1)，接種第2代殘耳軟骨細(xì)胞+常規(guī)負(fù)壓抽脂獲取的第3代hADSCs(1∶1)共培養(yǎng)，細(xì)胞濃度為 5.0×107cells/mL；實(shí)驗(yàn)組(Co-culture 2)，接種第2代殘耳軟骨細(xì)胞+第三代超聲輔助抽脂獲取的第3代hADSCs(1∶1)共培養(yǎng)，細(xì)胞濃度為 5.0×107cells/mL。3組細(xì)胞-支架復(fù)合物均置于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每周換液3次，體外培養(yǎng)4周后，每組取6個(gè)標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)檢測，剩余6個(gè)植入裸鼠體內(nèi)。

1.7 裸鼠體內(nèi)移植

每只裸鼠皮下分別植入對照組、實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2的細(xì)胞-支架復(fù)合物各1個(gè)，共6只裸鼠。對照組植入左背上部，實(shí)驗(yàn)組1植入左背下部，實(shí)驗(yàn)組2植入右背下部。體內(nèi)植入8周后取出進(jìn)行檢測。

1.8 相關(guān)評價(jià)指標(biāo)的檢測

對體外培養(yǎng)4周和體內(nèi)培養(yǎng)8周的各組標(biāo)本進(jìn)行大體觀察，包括新生組織的形態(tài)、大小和色澤，并進(jìn)行稱重。

阿利辛藍(lán)比色法檢測上述各組標(biāo)本的糖胺多糖(GAG)含量。

將各組標(biāo)本以 4%中性甲醛固定、石蠟包埋、切片。HE染色觀察細(xì)胞基本形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)；甲苯胺藍(lán)染色及 Safranin O 染色觀察軟骨組織的異染程度及基質(zhì)中 GAG 的分泌情況；Ⅱ型膠原免疫組化染色觀察各組標(biāo)本Ⅱ型膠原表達(dá)情況。

應(yīng)用生物力學(xué)分析儀對各組標(biāo)本進(jìn)行彈性模量檢測，以最大負(fù)荷250 N、0.3 mm/min的位移速度加壓，計(jì)算新生組織的彈性模量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 殘耳軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

原代殘耳軟骨細(xì)胞約12～24 h貼壁，48 h后開始增殖。細(xì)胞剛貼壁時(shí)為圓形，伸展后呈多角形，類似于同源細(xì)胞群的生長方式形成獨(dú)立的小群體，中央密集處可形成軟骨樣結(jié)節(jié)。一般8～10 d可達(dá)90%以上的匯合狀態(tài)。傳代后細(xì)胞生長速度加快，4 d即可接近匯合狀態(tài)，可繼續(xù)傳代。殘耳軟骨細(xì)胞隨傳代出現(xiàn)偽足狀細(xì)胞突起，呈現(xiàn)出更加明顯的長梭形外觀(圖1)。

A：殘耳軟骨；B：殘耳軟骨細(xì)胞. A: Microtia ear cartilage; B: Microtia chondrocytes.圖1 殘耳軟骨與殘耳軟骨細(xì)胞Fig. 1 Microtia ear cartilage and microtia chondrocytes

2.2 hADSCs形態(tài)觀察

第三代超聲輔助抽脂和常規(guī)負(fù)壓抽脂獲取的hADSCs接種48 h后都可見大部分細(xì)胞開始貼壁，為多角形的單層細(xì)胞,有的細(xì)胞體細(xì)長似成纖維細(xì)胞。72 h后大多數(shù)細(xì)胞貼壁，并開始伸展、分裂，呈梭形。5～7 d后細(xì)胞逐漸分裂、融合成單層并鋪滿底部。細(xì)胞平均傳代擴(kuò)增時(shí)間約為3 d，第3代細(xì)胞分裂增殖旺盛，細(xì)胞細(xì)長，排列緊湊且規(guī)律(圖2)。

A：UAL和SAL抽脂部位；B：UAL提取的hADSCs；C：UAL和SAL抽取的脂肪；D: SAL提取的hADSCs A: Liposuction area of UAL and SAL; B: hADSCs obtained by UAL; C: Adipose tissue obtained by UAL and SAL; D: hADSCs obtained by SAL圖2 通過UAL和SAL獲取hADSCsFig. 2 hADSCs obtained by UAL and SAL

2.3 hADSCs的定向誘導(dǎo)分化

成脂誘導(dǎo)分化72 h后，鏡下可見細(xì)胞立體感增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)有小脂滴出現(xiàn)，約1周后脂滴數(shù)量增加并相互融合，細(xì)胞由長梭形變?yōu)閳A形或多邊形，誘導(dǎo)第11天時(shí)，細(xì)胞分化達(dá)到高峰，可見大量脂滴融合成團(tuán)，油紅O染色陽性，顯示有大量脂質(zhì)沉淀(圖3B、E)。

A：SAL提取的hADSCs成骨分化；B：SAL提取的hADSCs成脂分化；C：SAL提取的hADSCs成軟骨分化；D：UAL提取的hADSCs成骨分化；E：UAL提取的hADSCs成脂分化；F：UAL提取的hADSCs成軟骨分化。 A: Osteogenic differentiation of hADSCs obtained by SAL; B: Adipogenic differentiation of hADSCs obtained by SAL; C: Chondrogenic differentiation of hADSCs obtained by SAL; D: Osteogenic differentiation of hADSCs obtained by UAL; E: Adipogenic differentiation of hADSCs obtained by UAL; F: Chondrogenic differentiation of hADSCs obtained by UAL圖3 hADSCs的鑒定Fig. 3 Identification of hADSCs

成骨誘導(dǎo)分化第4天時(shí)，細(xì)胞呈多角形，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞顆粒增多；第8天時(shí)胞質(zhì)內(nèi)充滿顆粒，細(xì)胞呈集落樣生長，細(xì)胞間見鈣質(zhì)沉積；第12天時(shí)細(xì)胞結(jié)節(jié)中心的細(xì)胞逐漸融合失去細(xì)胞結(jié)構(gòu)，鈣結(jié)節(jié)形成明顯；第14天時(shí)誘導(dǎo)分化達(dá)到高峰，可見大量鈣沉積，并融合成片，茜素紅染色陽性，呈紅色結(jié)節(jié)(圖3A、D)。

成軟骨誘導(dǎo)分化24 h后，細(xì)胞呈小顆粒狀漂浮在誘導(dǎo)液中，單個(gè)細(xì)胞形態(tài)無明顯變化。隨誘導(dǎo)時(shí)間延長，在密度較大處細(xì)胞逐漸聚集成群；誘導(dǎo)第7天即可在聚集細(xì)胞的表面看到微黃色的物質(zhì)積累，量逐漸增多；誘導(dǎo)第21天時(shí)達(dá)到高峰，阿爾新藍(lán)染色陽性(圖3C、F)。

2.4 體外培養(yǎng)4周時(shí)的細(xì)胞-支架復(fù)合物的大體、組織學(xué)觀察

體外培養(yǎng)4周后，大體觀察可見3組細(xì)胞-支架復(fù)合物均形成了類軟骨組織，呈微黃色、略有光澤，較薄。組織學(xué)觀察可見對照組1、對照組2與實(shí)驗(yàn)組均未形成基質(zhì)飽滿的類軟骨組織，組織結(jié)構(gòu)疏松，類似細(xì)胞-材料復(fù)合物生長的早期階段，僅有少量新生基質(zhì)的生長包裹，呈現(xiàn)軟骨特異性ECM沉積，仍有未降解的PGA支架材料。番紅O染色、Ⅱ型膠原染色、甲苯胺藍(lán)染色都可見稀少的新生基質(zhì)，分別表現(xiàn)為淡染的紅色、黃色、藍(lán)色(圖4)。

2.5 體內(nèi)培養(yǎng)8周時(shí)的細(xì)胞-支架復(fù)合物的大體、組織學(xué)觀察

體內(nèi)培養(yǎng)8周后取材，大體觀察可見3組細(xì)胞-支架復(fù)合物均形成了與原支架等大的類軟骨組織，色微黃，觸之有彈性。組織學(xué)觀察顯示，對照組1軟骨組織不均一，大部分區(qū)域形成成熟的軟骨組織，可見大量的軟骨陷窩和細(xì)胞外基質(zhì)分泌，但有部分區(qū)域組織結(jié)構(gòu)疏松，軟骨特異性ECM分泌較少；對照組2與實(shí)驗(yàn)組均形成成熟的軟骨組織，結(jié)構(gòu)均一，可見大量的軟骨陷窩和細(xì)胞外基質(zhì)分泌，支架材料已經(jīng)完全降解。番紅O染色、Ⅱ型膠原染色、甲苯胺藍(lán)染色都顯示強(qiáng)陽性(圖5)。

2.6 細(xì)胞-支架復(fù)合物稱重

對各組標(biāo)本進(jìn)行稱重，結(jié)果顯示對照組2與實(shí)驗(yàn)組均顯著優(yōu)于對照組1(P<0.05)，對照組2與實(shí)驗(yàn)組無顯著差異(P>0.05)(圖6 A)。

2.7 GAG含量檢測

對各組標(biāo)本進(jìn)行GAG含量檢測，結(jié)果顯示對照組2與實(shí)驗(yàn)組均顯著高于對照組1(P<0.05)，對照組2與實(shí)驗(yàn)組無顯著差異(P>0.05)(圖6B)。

圖4 體外培養(yǎng)4周細(xì)胞-支架復(fù)合物大體、組織學(xué)觀察。MC(對照組1)，Co-culture 1(對照組2)，Co-culture 2(實(shí)驗(yàn)組)Fig. 4 Gross view and histological observation of cell-scaffold complex after cultured 4 weeks in vitro. MC(ctrl group 1)， Co-culture 1(ctrl group 2)，Co-culture 2(Exp group)

圖5 體內(nèi)培養(yǎng)8周細(xì)胞-支架復(fù)合物大體、組織學(xué)觀察。MC(對照組1)，Co-culture 1(對照組2)，Coculture 2(實(shí)驗(yàn)組)Fig. 5 Gross view and histological observation of cell-scaffold complex after cultured 8 weeks in vivo. MC(ctrl group 1)， Co-culture 1(ctrl group 2)，Co-culture 2(Exp group)

圖6 體外培養(yǎng)4周和體內(nèi)培養(yǎng)8周各組濕重、GAG含量、楊氏模量的比較。MC(對照組1)，Co-culture 1(對照組2)，Co-culture 2(實(shí)驗(yàn)組)Fig. 6 The comparisons of wet weight, GAG content and Young’s modulus among the 3 groups after cultured 4 weeks in vitro and 8 weeks in vivo. MC(ctrl group 1)，Co-culture 1(ctrl group 2)，Co-culture 2(Exp group)

2.8 生物力學(xué)檢測

各組標(biāo)本彈性模量檢測結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)4周后，3組標(biāo)本力學(xué)強(qiáng)度都很低，對照組2與實(shí)驗(yàn)組顯著優(yōu)于對照組1(P<0.05)，對照組2與實(shí)驗(yàn)組無差異(P>0.05)。但經(jīng)過體內(nèi)8周的重塑后，3組標(biāo)本的彈性模量都有明顯提升，對照組2與實(shí)驗(yàn)組顯著優(yōu)于對照組1(P<0.05)，對照組2與實(shí)驗(yàn)組無顯著差異(P>0.05)(圖6C)。

3 討論

構(gòu)建組織工程軟骨耳郭最主要的問題是種子細(xì)胞的來源，小耳畸形患者的殘耳軟骨組織往往較小，不足以提供足量的殘耳軟骨細(xì)胞，而過度體外擴(kuò)增將使軟骨細(xì)胞逐漸失去表型及分泌軟骨基質(zhì)的能力，進(jìn)而失去成軟骨能力[10-11]。而ADSCs來源廣、易獲得、純化率高、體外增殖速度快，是構(gòu)建軟骨組織的理想種子細(xì)胞。ADSCs成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)的研究較多，但傳統(tǒng)的誘導(dǎo)方法需要大量生長因子，難以應(yīng)用于臨床。研究發(fā)現(xiàn)，軟骨微環(huán)境能有效促進(jìn)干細(xì)胞成軟骨分化，形成軟骨樣組織并用于修復(fù)缺損[12-13]。微環(huán)境可能的作用機(jī)制為：軟骨細(xì)胞分泌 TGF-β、IGF 等生長因子，誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨方向分化[10]；相鄰細(xì)胞間的相互作用[11]；分泌軟骨微環(huán)境特異性細(xì)胞外基質(zhì)，作用于細(xì)胞的增殖、分化、黏附及細(xì)胞間信號傳導(dǎo)等。研究顯示，殘耳軟骨細(xì)胞在體外獨(dú)立模擬軟骨誘導(dǎo)微環(huán)境，能夠誘導(dǎo)ADSCs定向分化并形成軟骨組織[14]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用ADSCs和殘耳軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)來構(gòu)建軟骨組織，濕重、糖胺多糖、生物力學(xué)檢測都顯示對照組2與實(shí)驗(yàn)組均顯著優(yōu)于對照組1，對照組2與實(shí)驗(yàn)組間無顯著差異。組織學(xué)染色結(jié)果類似，對照組2與實(shí)驗(yàn)組形成的軟骨組織結(jié)構(gòu)均一，可見有大量的軟骨陷窩和細(xì)胞外基質(zhì)分泌，對照組1軟骨組織不均一，有部分區(qū)域組織結(jié)構(gòu)疏松，軟骨特異性ECM分泌較少。由此推斷，殘耳軟骨細(xì)胞微環(huán)境對ADSCs的軟骨方向分化具有確切的促進(jìn)作用，共培養(yǎng)組中的ADSCs能替代一定量的殘耳軟骨細(xì)胞形成軟骨樣組織。

超聲輔助吸脂的基本原理是將電能轉(zhuǎn)化為振動(dòng)，引起熱效應(yīng)、空泡效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)，從而導(dǎo)致脂肪碎裂；超聲能量會(huì)選擇性地分解脂肪組織，對組織損傷較小，從而在減少出血的情況下實(shí)現(xiàn)抽脂。本實(shí)驗(yàn)中超聲輔助吸脂和常規(guī)負(fù)壓吸脂獲得的ADSCs都可以進(jìn)行成骨、成脂和成軟骨分化，并且超聲輔助吸脂和常規(guī)負(fù)壓吸脂獲得的ADSCs與殘耳軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)都可以成功構(gòu)建組織工程軟骨，兩者之間無顯著差異，表明超聲能量對ADSCs無不良影響。

綜上所述，應(yīng)用第三代超聲輔助吸脂可以安全有效地獲取ADSCs，超聲能量對ADSCs無不良影響；應(yīng)用第三代超聲輔助抽脂獲取的hADSCs+殘耳軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，可形成成熟的組織工程軟骨。