程 艷,張 濤,蘇小明,滿 竹,馬艷艷,李建華,張耀剛,田美媛,侯 靜,黃登亮

(1.青海大學,西寧810016;2.青海大學附屬醫(yī)院中心實驗室,西寧810001)

國內(nèi)外學者從多方面研究腦卒中發(fā)病機制,發(fā)現(xiàn)線粒體參與缺血性腦卒中發(fā)病的各環(huán)節(jié),線粒體作為有氧呼吸和ATP產(chǎn)生的主要場所,是細胞內(nèi)耗氧量最大的細胞器,其功能與細胞多種生命活動密切相關(guān),如ROS的產(chǎn)生、細胞的凋亡等。當ROS在線粒體中積累時損傷線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)。有學者發(fā)現(xiàn)線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor

A,TFAM)是由核基因編碼的線粒體核心功能調(diào)控因子之一,可調(diào)控mtDNA的轉(zhuǎn)錄、復制、修復;TFAM是線粒體代謝的主要調(diào)控點,可以抑制細胞凋亡,減少ROS的產(chǎn)生,對mtDNA的損傷修復起重要作用[1]。但目前對TFAM在腦卒中的作用研究不足,本研究通過線栓法建立缺血性大鼠腦卒中模型,觀察TFAM與腦卒中線粒體生物學功能的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物

54只健康雄性SD大鼠(250～280g)由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供(許可證號：3201111979),隨機分為正常組(NORMAL)、假手術(shù)組(SHAM)、大腦中動脈阻塞組(MCAO),每組18只。后兩組在組內(nèi)再分為2、6、12 h三個時間點組。

1.1.2 主要儀器和試劑

3激光12色流式細胞儀(BD),動物飼養(yǎng)IVC系統(tǒng)(TECNIPLAST),普通純水儀(PC210EUBPM1),超純水儀(CLXXUVFM2),超低溫冰箱(EXF60086V),超微量核酸蛋白測定儀(Nanodrop2000C),熒光實時定量PCR儀(ROCHE Light,Cycler

480),立體動物手術(shù)顯微鏡(OLYMPUS),PCR梯度儀(Mastercycle nexux,GSX1);SYBRGreen(Roch,04913850001),Trizol(TaKaRa,9109),TTC(Biottopped,298964),蛋白酶抑制劑PMSF(BOSTER,AR1179),Anti-NeuN(abcam,ab177487),TFAM抗體(santa,166965);RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransGen,AT311),PI+AnixV-FITC凋亡檢測試劑盒(BD,556547),JC-1試劑盒(BD,551302);TFAM和β-actin引物(Shanghai Sangon

company)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠造模

大鼠術(shù)前一日禁食不禁水,參照文獻[2]改良線栓法制成MCAO模型：用10%的水合氯醛(3mL/kg)行腹腔注射麻醉,仰臥固定,在立體顯微鏡下分離右側(cè)頸總動脈、迷走神經(jīng)、頸內(nèi)動脈,結(jié)扎頸總動脈后在頸總動脈處掛線,用動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈遠心端后,距動脈分叉4

mm處剪一斜型切口,將線栓由頸總動脈插人頸內(nèi)動脈,取下動脈夾,插入深度約(18.5±0.5)mm,稍遇阻力即停,固定線栓,剪斷栓尾,依次縫合皮下及皮膚各層,用碘伏消毒后返籠,給予正常飲食(水)。術(shù)中及術(shù)后注意保暖。SHAM組只分離血管和神經(jīng)后縫合。術(shù)后清醒后對MCAO組及SHAM組大鼠參考Zea Longa[3]等制定的4級評分法進行神經(jīng)功能損傷評分,0分：未出現(xiàn)神經(jīng)損傷癥狀;1分：不能伸展對側(cè)前爪;2分：向一側(cè)轉(zhuǎn)圈或追尾;3分：向?qū)?cè)傾倒;4分：不能行走,意識喪失。1～3分大鼠納入實驗,0、4分及死亡大鼠排除在外。

1.2.2 神經(jīng)元TFAM mRNA表達取在-80℃冰箱保存的大鼠腦組織標本約0.2

g,在液氮中快速研磨成粉末,根據(jù)Trizol說明書提取腦組織RNA,測濃度及純度,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明在冰上將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取2μL作為模板進行 qPCR反應(yīng),TFAM上游引物：5′-TGACGAGT-TCTGCCGTTTGC-3′,TFAM 下游引物：5′-AACCCGCACGAAACTGTCAC-3′;內(nèi)參 β-actin 上游引物：5′-CACTTTCTACAATGAGCTGCG-3′,內(nèi)參 β-actin 下游引物：5′-CTGGATGGCTACGTACATGG-3′。 qPCR 數(shù)值分析采用2-ΔΔCT分析法,用Graph pad8.0軟件分析并做圖。

1.2.3 神經(jīng)元TFAM蛋白表達

取100mg置-80℃冰箱保存的腦組織,在液氮中快速研磨成粉末狀,加入0.5 mL RIPA(含PMSF)充分裂解腦組織提取蛋白,用Bradford法測其濃度。各組取等量蛋白行SDS-PAGE電泳,濕轉(zhuǎn)至PVDF膜,用含5%脫脂牛奶的PBST溶液封閉PVDF膜,用山羊抗小鼠TFAM抗體(1：200)與封閉后的PVDF膜在室溫下孵育2 h;用 PBST 洗膜,用二抗(1：5000)在室溫下孵育PVDF膜2 h;用PBST洗膜后采用ECL法顯色。利用圖像處理軟件Image J對蛋白電泳圖行灰度分析,并以兩者的比值作為目的蛋白的相對定量值。

1.2.4 流式細胞懸液的制備及神經(jīng)元線粒體膜電位、凋亡的檢測

將大鼠麻醉后快速斷頭取腦,在冰上于HBSS緩沖液中快速剝除腦膜、血管膜,取右側(cè)新鮮缺血側(cè)腦組織0.1 g,在含有HBSS的溶液中充分研磨,制成單細胞懸液,離心(1000r/min)10 min,棄上清液,裂解紅細胞,調(diào)細胞濃度至2×106個/mL。按照說明用Anti-NeuN一抗和山羊抗兔FITC標記神經(jīng)元后,按照線粒體膜電位(JC-1)和凋亡試劑盒說明書要求孵育相關(guān)抗體,上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析;結(jié)果用均數(shù)±標準差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,多重兩兩比較采用LSD檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)元TFAM的mRNA表達分析

通過熒光染料法qPCR檢測大鼠腦組織中的TFAM mRNA水平,利用各組檢測數(shù)據(jù)進行定量分析(表1)。由定量結(jié)果可知,與NORMAL組相比,2h SHAM組的TFAM mRNA水平顯著下降,隨后逐漸上升,在12 h組中恢復至NORMAL組水平;相對于NORMAL組,SHAM組中TFAM mRNA水平的變化反映了麻醉及手術(shù)創(chuàng)傷本身對大鼠腦組織TFAM mRNA水平的影響,該影響隨大鼠術(shù)后恢復而逐漸消失。MACO組與SHAM組的對比可以反映缺血性腦卒中(右側(cè)頸總動脈阻斷大腦中動脈血流)對大鼠腦組織中TFAM mRNA水平的影響,實驗結(jié)果顯示TFAM mRNA水平在缺血2 h時顯著上調(diào)(P＜0.05),隨缺血時間延長而下降,缺血12 h組與6 h組無明顯差異,在12 h時顯著低于NORMAL組和SHAM組(P＜0.05)。以上結(jié)果表明,腦卒中早期,腦組織中的TFAM mRNA水平上調(diào),但隨腦卒中時間延長而下調(diào)至低于正常的水平。

表1 大鼠腦PCR的TFAM 2-ΔΔCT 值Table 1 The value of TFAM 2-ΔΔCT of PCR in rats(±s)

表1 大鼠腦PCR的TFAM 2-ΔΔCT 值Table 1 The value of TFAM 2-ΔΔCT of PCR in rats(±s)

☆：與NORMAL組比較,P＜0.05;★：與SHAM 2 h組比較,P＜0.05;*：與SHAM 6 h組比較,P＜0.05;▼：與 SHAM 12 h組比較,P＜0.05;Δ：與 MCAO 2 h組比較,P＜0.05

Group n TFAM 2-ΔΔCT NORMAL 6 1.02±0.22 2h 6 1.15±0.50★*MCAO 6h 6 0.17±0.08☆▼Δ MCAO 12h 6 0.23±0.09☆▼Δ SHAM 2h 6 0.10±0.06☆▼Δ SHAM 6h 6 0.21±0.18☆Δ SHAM 12h 6 1.14±0.72★*MCAO F 10.069 P-0.000-

2.2 各組神經(jīng)元TFAM蛋白表達分析

通過Western Blot檢測TFAM和β-actin蛋白水平(圖2)的灰度值,將TFAM蛋白灰度值根據(jù)其對應(yīng)β-actin蛋白灰度值進行標準化并定量分析。分析結(jié)果表明(表2),與NORMAL相比,SHAM組大鼠腦組織中TFAM蛋白水平受麻醉和手術(shù)創(chuàng)傷的影響先降低,而后恢復到正常水平,這與上述TFAMmRNA水平的變化趨勢一致;與SHAM組相比,腦卒中2h的MACO組大鼠腦組織中TFAM蛋白水平顯著上調(diào)(P＜0.05),并在腦卒中12 h時繼續(xù)上調(diào)(P＜0.05),顯著高于NORMAL組(P＜0.05)和SHAM組的TFAM蛋白水平,表明在腦卒中早期(2h),腦組織中的TFAM蛋白水平上調(diào),并隨腦卒中時間延長(12h)而繼續(xù)上調(diào)。

圖1 各組大鼠腦組織中的TFAM蛋白水平Figure 1 Levels of TFAM protein in brain tissues of each group of rats

表2 大鼠腦TFAM蛋白灰度值Table 2 Gray scale of brain TFAM protein in rats(±s)

表2 大鼠腦TFAM蛋白灰度值Table 2 Gray scale of brain TFAM protein in rats(±s)

☆：與NORMAL組比較,P＜0.05;★：與SHAM 2 h組比較,P＜0.05;*：與SHAM 6 h組比較,P＜0.05;○：與 SHAM 12 h組比較,P＜0.05;▼：與 MCAO 2 h組比較,P＜0.05

Group n Gray values of TFAM protein NORMAL 6 0.62±0.04 MCAO 2h 6 0.64±0.04★MCAO 6h 6 0.58±0.01★MCAO 12h 6 0.82±0.01☆★*▼○2h 6 0.39±0.02☆★*▼○SHAM 6h 6 0.61±0.06☆★○SHAM 12h 6 0.71±0.07★*F-46.445 SHAM P -0.000

2.3 各組神經(jīng)元線粒體膜電位及凋亡分析

通過流式細胞術(shù)檢測各組大鼠的腦皮層神經(jīng)元線粒體膜電位,P4門中標記的是線粒體膜電位降低的細胞(圖2);根據(jù)流式細胞術(shù)檢測結(jié)果,將各組中線粒體膜電位降低的神經(jīng)元進行定量分析,與NORMAL組相比,SHAM 2 h組神經(jīng)元線粒體膜電位顯著下降,與SHAM 6 h組、SHAM 2 h組相比有顯著差異,SHAM 12 h組中線粒體膜電位有所恢復,表明手術(shù)本身因素(如麻醉和創(chuàng)傷)對腦皮層神經(jīng)元的線粒體膜電位有影響;與SHAM組相比,MACO 2h組神經(jīng)元線粒體膜電位顯著低于SHAM組(P＜0.05);MACO 6h組神經(jīng)元線粒體膜電位有所恢復,SHAM組神經(jīng)元線粒體膜電位低于MACO組(P＜0.05);MACO 12h組和SHAM 6h、SHAM 12h組神經(jīng)元線粒體膜電位相比無顯著差異(表3)。

圖2 各組神經(jīng)元線粒體膜電位檢測圖Figure 2 Detection ofm itochondrialmembrane potential of nerve cells in each group

表3 線粒體膜電位JC-1單體Table 3 M itochondrial JC-1 monomer(±s)

表3 線粒體膜電位JC-1單體Table 3 M itochondrial JC-1 monomer(±s)

*：與NORMAL組比較,P＜0.05;△：與SHAM 2 h組比較,P＜0.05;★：與 SHAM 6 h組比較,P＜0.05;▼：與 SHAM 12 h組比較,P＜0.05;#：與 MCAO 2 h組比較,P＜0.05;☆：與 MCAO 6 h組比較,P＜0.05

Group n JC-1monomer NORMAL 5 15.62±1.22 2h 5 65.52±2.15*△▼★☆MCAO 6h 5 26.88±1.27*△▼#★MCAO 12h 5 38.40±2.38*△#☆SHAM 2h 5 50.16±1.51*▼#MCAO 6h 5 43.90±1.96*△★☆SHAM 12h 5 39.34±1.08△☆F-347.448 SHAM P -0.000

在用PI+AnnexinV-FITC檢測細胞凋亡的實驗中,PI標記陰性而AnnexinV-FITC標記陽性,陽性者是早期凋亡的細胞,在流式細胞術(shù)檢測中,是位于Q4門中的細胞(圖3);在對NORMAL、SHAM和MACO三個組的大鼠皮層神經(jīng)元進行流式細胞術(shù)檢測之后,將各組凋亡早期的細胞進行統(tǒng)計并做定量分析(表4)。SHAM 2h組和MACO組的細胞凋亡水平有差異,且均顯著高于NORMAL組細胞凋亡水平(P＜0.05);SHAM 6h組和MACO組的細胞凋亡水平降低且低于NORMAL組,但SHAM組和MACO組無差異;與6 h相比,SHAM 12h組和MACO組的細胞凋亡水平升高(P＜0.05),MACO組水平顯著低于SHAM組(P＜0.05)。

圖3 流式檢測大鼠皮層神經(jīng)元凋亡圖Figure 3 Detection of the apop tosis of cortical neurons by Flow cytom etry in rats

表4 大鼠腦神經(jīng)元凋亡數(shù)Table 4 The number of brain neuron apoptosis in rats(±s)

表4 大鼠腦神經(jīng)元凋亡數(shù)Table 4 The number of brain neuron apoptosis in rats(±s)

*：與NORMAL組比較,P＜0.05;△：與SHAM 2 h組比較,P＜0.05;☆：與 SHAM 6 h組比較,P＜0.05;▼：與 SHAM 12 h組比較,P＜0.05;#：與 MCAO 2 h組比較,P＜0.05;?：與MCAO 6 h組比較,P＜0.05

Group n The number of neuron apoptosis NORMAL 5 71.04±1.69 2h 5 86.28±3.31*△☆▼?MCAO 6h 5 46.88±2.54*△▼#MCAO 12h 5 56.76±1.72*△☆▼#?SHAM 2h 5 80.94±0.94*☆#SHAM 6h 5 46.36±1.40*△?SHAM 12h 5 74.08±0.84☆△F-271.080 MCAO P -0.000

3 討論

局部腦組織缺血、缺氧,使神經(jīng)元線粒體能量產(chǎn)生減少,活性氧的產(chǎn)生增加,鈣內(nèi)流,內(nèi)源性凋亡通路激活,致神經(jīng)元受損[4]。本次研究也發(fā)現(xiàn)模型組線粒體膜電位較對照組低,早期凋亡參與發(fā)病過程,進一步闡釋了線粒體功能障礙與腦卒中發(fā)病相關(guān)。腦缺血2 h起對神經(jīng)元線粒體膜電位產(chǎn)生影響,直到線粒體膜電位在6 h時逐漸恢復并接近正常水平,這說明腦缺血引起的神經(jīng)元線粒體膜電位降低要早于腦組織壞死發(fā)生,這也與神經(jīng)元在腦缺血2 h時就已經(jīng)發(fā)生早期凋亡的結(jié)果相一致?；钚匝醯拇罅慨a(chǎn)生致細胞線粒體DNA、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生嚴重損傷[5]。本研究顯示,在腦缺血6 h時腦組織壞死明顯,可能是腦缺血后6 h時神經(jīng)元TFAM降低的主要原因。有研究表明在心肌細胞缺血缺氧時,TFAM能夠抑制線粒體ROS的產(chǎn)生而使mtDNA免受損傷[6]。此外發(fā)現(xiàn)過表達TFAM可抑制心肌梗死后mtDNA拷貝數(shù)及細胞凋亡水平,促進線粒體的生物合成[7,8]。研究者建立過表達TFAM轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠模型,對野生型(WT)和TFAM-Tg小鼠均行20 min雙側(cè)頸總動脈閉塞,過表達TFAM小鼠海馬CA1區(qū)細胞色素C陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯少于WT小鼠,TUNEL神經(jīng)元數(shù)量顯著低于WT小鼠,表明TFAM過表達可能是通過減少線粒體的通透性改變來減少遲發(fā)性神經(jīng)元的死亡,其機制不明[9]。而在本研究中,腦缺血2 h線粒體膜電位的降低引起了神經(jīng)元的早期凋亡,TFAM可能維持了線粒體的完整性,但并沒有阻止線粒體膜電位降低及神經(jīng)元的早期凋亡,而該過程可能有其他通路參與。

線粒體作為細胞內(nèi)重要有氧呼吸和產(chǎn)能的細胞器,對缺氧極其敏感,大量活性氧釋放到細胞質(zhì)中,使mtDNA受到損傷(形態(tài)改變)[10]。TFAM是核基因編碼后轉(zhuǎn)移到線粒體內(nèi)的一種小分子肽,是mtDNA轉(zhuǎn)錄、復制的重要激活因子,維持mtDNA完整性,可抑制細胞凋亡[11]。大鼠腦缺血6 h后開始出現(xiàn)明顯的組織壞死,但神經(jīng)元在腦梗發(fā)生2 h時就已發(fā)生凋亡而且程度明顯大于SHAM及NORMAL組,直到6 h時凋亡發(fā)生率逐漸降到最低值,這也可能與6 h時腦組織開始壞死有關(guān)。在12h時SHAM組凋亡水平接近NORMAL組,而MCAO組神經(jīng)元的凋亡都低于SHAM及NORMAL組,這可能與手術(shù)后對腦組織造成持續(xù)性損傷有關(guān)。有學者發(fā)現(xiàn),細胞發(fā)生氧化應(yīng)激時,PGC-1α表達上調(diào)使TFAM的表達增加,從而致TFAM與mtDNA的親和力增加,進而維持mtDNA的穩(wěn)定性,促進其修復。然而,隨著氧化損傷的進一步加重致細胞核DNA損傷,使TFAM的表達量減少[12]。研究結(jié)果顯示,腦卒中2 h時,可能因細胞的應(yīng)激作用使TFAM的表達增高,但不能抑制線粒體膜電位的下降及細胞的早期凋亡。隨著神經(jīng)元損傷加重,在缺血6 h時TFAM的表達漸趨穩(wěn)定,膜電位也逐漸接近正常水平,細胞凋亡率降低。

缺氧使線粒體能量障礙,引起MPTP開放,使線粒體膜電位降低[13]。本研究也顯示MCAO模型組線粒體膜電位較兩對照組低。在發(fā)生缺氧及其他應(yīng)激損傷時,內(nèi)膜通透性會發(fā)生改變,基質(zhì)內(nèi)的Ca2+和炎癥因子等進入胞質(zhì),引起細胞調(diào)亡[14]。目前有研究還發(fā)現(xiàn),抑制大鼠腦缺血線粒體凋亡和動力相關(guān)蛋白1的激活、改善線粒體功能障礙和凋亡可抑制H2O2誘導的神經(jīng)元凋亡[15];促進線粒體生成生物合成,維持其結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定,可以降低受損神經(jīng)元的凋亡,有利于腦功能的恢復[16]。ROS可以和MPTP上二硫鍵結(jié)合調(diào)控MPTP而降低線粒體膜電位[17]。TFAM在線粒體的生物學合成中起重要作用,除了參與mtDNA的轉(zhuǎn)錄、復制,還參與mtDNA的合成后修飾和校對,其含量的變化引起線粒體膜電位的改變[18,19]。本實驗結(jié)果顯示隨著腦缺血時間延長,TFAM的表達降低,MCAO組線粒體膜電位均較對照組低,這也闡明了線粒體膜電位與腦缺血后神經(jīng)元損傷之間的相關(guān)性。TFAM缺失會導致線粒體功能的紊亂,因而與線粒體疾病、神經(jīng)退行性疾病和衰老等密切相關(guān)[20,21],所以增加TFAM的量可能起到一定的神經(jīng)保護作用。

綜上所述,腦缺血2 h時,在神經(jīng)細胞尚未出現(xiàn)損傷的情況下,TFAM可能通過調(diào)節(jié)線粒體數(shù)量和功能而起一定作用,但不能阻止線粒體膜電位的降低和神經(jīng)元的早期凋亡。腦缺血6 h后,由于神經(jīng)元損傷加重影響了TFAM轉(zhuǎn)錄,隨著TFAM表達量漸趨穩(wěn)定,線粒體膜電位下降率和凋亡率降低。