李超群,張發(fā)斌,趙 婧,李鳳輝,高瑞雪,樊海寧

(1.青海大學醫(yī)學院;2.青海大學附屬醫(yī)院;3.青海省包蟲病研究重點實驗室)

目前,疫苗因具有安全、無殘留、動物無休藥期的優(yōu)點在棘球蚴病的防治中得到廣泛地研究、應(yīng)用[1]。預測抗原表位有助于了解抗體抗原識別的免疫基礎(chǔ),有助于疫苗設(shè)計和藥物研發(fā)[2]。

本研究通過相關(guān)課題設(shè)計,對細粒棘球絳蟲肌動蛋白(Echinococcus granulosus actin Eg ACT)的結(jié)構(gòu)和抗原表位進行分析,為篩選疫苗候選抗原提供依據(jù)。

1 研究方法

1.1 氨基酸序列獲取

通過GenBank數(shù)據(jù)庫查尋下載細粒棘球絳蟲肌動蛋白的氨基酸序列,登錄號為EUB56817.1。

1.2 蛋白質(zhì)特性預測

利用Expasy線上分析系統(tǒng)(https：//web.expasy.org/protparam/)的protparam數(shù)據(jù)庫預測細粒棘球絳蟲肌動蛋白的等電點、相對分子量、穩(wěn)定性等理化性質(zhì),利用Expasy系統(tǒng)的protscale數(shù)據(jù)庫預測親/疏水區(qū)域。利用SignalP-5.0 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和 TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)軟件確定蛋白質(zhì)信號肽序列與跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域,利用DNAstar Protean線下軟件分析蛋白的親水性、柔性區(qū)域、抗原指數(shù)及表面可及性。利用 SOPMA 和 SWISS-MODEL(http：//swissmodel.expasy.org)在線軟件預測空間結(jié)構(gòu)中的二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)。

1.3 蛋白質(zhì)抗原表位預測

用DNAstar Protean線下軟件中的AMPHI法預測輔助性T淋巴細胞抗原表位、Rothbard-Taylor法預測T淋巴細胞抗原表位,綜合兩種方法分析獲得優(yōu)勢T細胞表位;用IEDB軟件和ABCpred軟件綜合預測細粒棘球絳蟲肌動蛋白的優(yōu)勢B細胞表位。

2 結(jié)果

2.1 Eg ACT的理化性質(zhì)

如表1所示,細粒棘球絳蟲肌動蛋白相對分子質(zhì)量為41.95 kDa;等電點為5.38;半衰期為30h(mammalian)＞20 h(yeast)＞10h(Escherichiacoli)。該蛋白經(jīng)過穩(wěn)定性分析顯示,其不穩(wěn)定指數(shù)為39.28,小于40,為穩(wěn)定蛋白。

對蛋白質(zhì)信號肽序列與跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域進行分析,所得結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)無信號肽序列、無跨膜螺旋區(qū)域。

2.2 空間結(jié)構(gòu)特性

如圖1所示,Eg ACT的二級結(jié)構(gòu)中β轉(zhuǎn)角占6.65%、α螺旋占38.83%、延伸鏈占21.54%、無規(guī)則卷曲占32.98%,以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主。

圖1 Eg ACT二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果圖Figure 1 Predictio.Results of Eg ACT secondary structure

如圖2所示,Eg ACT的三級結(jié)構(gòu)呈多折疊型。

圖2 Sw issmodel網(wǎng)站構(gòu)建的Eg ACT三級結(jié)構(gòu)圖Figure 2 The three-level structure of Eg ACT built by the Sw issmodel website

2.3 親水性、柔性區(qū)域、抗原指數(shù)及表面可及性

如圖3所示,綜合Expasy和DNAstar Protean軟件分析結(jié)果,該蛋白可明顯看到分布較多的親水性區(qū)域,位于 21-30、50-67、70-92、95-106、109-121、191-216、222-246、283-295、311-321、331-340、355-346氨基酸區(qū)段,這些區(qū)域暴露于蛋白表面,易于形成抗原表位。

圖3 Expasy與Protean軟件預測的親/疏水區(qū)Figure 3 The pro-hydrophobic region predicted by Expasy and Protean software

如圖4所示,柔性區(qū)域呈散在分布,較明顯的分布區(qū)域位于 12-30、37-42、57-63、79-85、107-118、195-208、232-240、282-293、312-319、360-368 氨基酸區(qū)段。表面可及性得分較高的區(qū)域主要位于58-63、78-86、109-119、231-244、286-294、312-318、359-365氨基酸區(qū)段?？乖灾笖?shù)得分較高區(qū)域與柔性區(qū)域的分布一致。

圖4 Eg ACT柔性區(qū)域、抗原指數(shù)及表面可及性區(qū)域圖Figure 4 Eg ACT proteinflexible region,antigen index and surface accessibility region

2.4 B細胞表位

ABCpred軟件預測閾值＞0.8的優(yōu)勢B細胞表位的氨基酸序列區(qū)域位于13-29、42-72、74-90、173-189、210-242、245-261、283-299、302-318、327-343氨基酸區(qū)段;如圖5所示,IEDB軟件預測長度大于6個氨基酸的區(qū)域位于14-31、36-42、52-61、77-82、97-105、108-118、155-165、199-208、233-244、285-290、319-325、361-369 氨基酸區(qū)段。 綜合上述兩種軟件預測結(jié)果,可能形成的優(yōu)勢B細胞表位氨基酸序列位于 14-29、52-61、77-82、233-242、285-290氨基酸區(qū)段。

2.5 T細胞表位

如圖6所示,AMPHI法預測可能形成輔助性T淋巴細胞抗原表位的區(qū)域位于29-36、75-91、185-193、208-217、220-228、273-285、309-321、346-355氨基酸區(qū)段;Rothbard-Taylor法預測可能的T淋巴細胞抗原表位位于 21-24、52-56、75-78、85-88、126-129、148-155、185-195、208-211、227-230、232-235、260-264、274-277、209-312、320-323、355-359氨基酸區(qū)段。綜合上述兩種軟件預測結(jié)果,可能的優(yōu)勢T細胞表位區(qū)域位于75-78、85-88、185-193、208-211、274-277、309-312 氨基酸區(qū)段。

圖5 IEDB軟件預測的Eg ACT B細胞線性表位圖Figure 5 Eg ACT B cells predicted by IEDB software

圖6 DNAStar軟件預測的T細胞表位圖Figure 6 T-cell epitopes predicted by DNAStar software

3 討論

本研究借助生物信息學的方式,對細粒棘球絳蟲肌動蛋白的結(jié)構(gòu)和抗原表位進行了分析,為篩選疫苗候選抗原提供了依據(jù)。

抗原表位為抗原分子表面一種特有的結(jié)構(gòu),可刺激機體產(chǎn)生能夠被其識別的一個免疫活性區(qū),該免疫活性的氨基酸基團又稱為抗原決定簇。借助生物信息學的方式預測抗原表位的成本低、效率高[3]。

本研究通過蛋白分析軟件對細粒棘球絳蟲肌動蛋白的理化性質(zhì)進行分析,確定該蛋白是否適宜作為研究對象。對蛋白質(zhì)的信號肽和跨膜區(qū)域進行分析,確定該蛋白分布是否存在跨膜區(qū)域,是否為分泌蛋白并參與轉(zhuǎn)運。對二級結(jié)構(gòu)中的β轉(zhuǎn)角、α螺旋、無規(guī)則卷曲等進行分析是為了解其與抗體結(jié)合的難易程度[4]。本研究發(fā)現(xiàn),細粒棘球絳蟲肌動蛋白的β轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲所占二級結(jié)構(gòu)的比例之和超過50%較易形成抗原表位。

分析親水性、柔性區(qū)域、抗原性指數(shù)及表面可及性區(qū)域是為了解各個氨基酸殘基的分布情況,親水性區(qū)域一般位于蛋白質(zhì)表面,細粒棘球絳蟲肌動蛋白親水性區(qū)域較多,易形成抗原表位;抗原性指數(shù)得分較高區(qū)域更易形成抗原表位;表面可及性區(qū)域反映蛋白質(zhì)與其他分子的接觸情況。

綜合分析細粒棘球絳蟲肌動蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特點和優(yōu)勢B、T細胞表位區(qū)域顯示,該蛋白具有穩(wěn)定性蛋白特征和易形成抗原表位的特點。