高瑞雪,李超群,張耀剛,李鳳輝,趙 婧,姜博璠,張發(fā)斌*

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院,青海西寧810001;2.青海省包蟲病研究重點實驗室,青海西寧810001)

近年來,利用基因工程技術(shù)分析細(xì)粒棘球絳蟲的有效成分,尋找特異性高的抗原分子成為細(xì)粒棘球蚴病早期診斷的研究熱點[1-2]。細(xì)粒棘球絳蟲肌動蛋白基因是一種用患者血清從細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)蛋白中篩選出的抗原性蛋白[3,4]。本研究擬通過克隆表達(dá)細(xì)粒棘球絳蟲肌動蛋白基因獲得純化蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料

cDNA由青海省包蟲病研究重點實驗室提供。實驗所需的表達(dá)載體PET28a-SUMO,限制性內(nèi)切酶BamHI、Xhol,鎳柱(1mL),兔抗His標(biāo)簽抗體IgG,羊抗兔抗體IgG由上海生物工程有限公司提供。DNA凝膠回收試劑盒、T4連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒由天根生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 EgACT基因的合成

在GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取EgACT基因編碼序列,經(jīng)全序列合成、密碼子優(yōu)化后合成目的基因。合成產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳后在紫外光下切取目的基因,并用DNA凝膠回收試劑盒純化回收DNA。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建[5]

依據(jù)參考文獻(xiàn)方法回收產(chǎn)物與原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-SUMO,采用限制性內(nèi)切酶 BamHI、Xhol進(jìn)行雙酶切。以8μL酶切目的片段(液)、4μL酶切載體 pET28a、2μL 10×T4 DNAligase Buffer、1μL T4 DNAligase(5u/μL)加ddH2O 至20μL,在22℃下連接1 h,獲得重組質(zhì)粒,取10μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入top10感受態(tài)中,篩選出陽性克隆物,送上海生物工程有限公司進(jìn)行測序鑒定。

1.2.3 重組蛋白的表達(dá)和純化[6]

依據(jù)參考文獻(xiàn)方法誘導(dǎo)表達(dá),取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rosetta(DE3)感受態(tài),在涂板篩選單菌落,接種于含卡那霉素和氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中(37℃,220rpm氣浴恒溫振蕩器)培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)的菌液按1：100比例接種于同樣含有卡那霉素和氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中(37℃,220rpm氣浴恒溫振蕩器)培養(yǎng),當(dāng)OD值約為0.6時,吸出1 mL未經(jīng)誘導(dǎo)的培養(yǎng)液保存(4℃)。使用時加入IPTG至終濃度為0.5 mM后誘導(dǎo)過夜(20℃),離心(12000r/min,5min)收集細(xì)菌菌體,在冰浴狀態(tài)下經(jīng)過超聲裂解收集沉淀,沉淀在破碎Buffer中經(jīng)超聲裂解獲得上清液,采用鎳瓊脂糖凝膠親和層析法進(jìn)行蛋白純化、去除雜蛋白,將所得組分透析過夜(1×PBS,2mM DTT,pH7.4),透析結(jié)束后用PEG20000濃縮、濾膜(0.22μm)過濾后分裝、保存(-80℃)。

1.2.4 純化蛋白表達(dá)的檢測

配置12%的分離膠和5%的濃縮膠,對純化后的蛋白進(jìn)行電泳,用考馬斯亮藍(lán)染色20 min,脫色,檢測蛋白表達(dá)情況。

1.2.5 純化蛋白濃度的測定

采用SK3071非干擾型蛋白定量試劑盒測定純化蛋白EgACT蛋白濃度。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pET28a-SUMO-EgACT鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒雙酶切鑒定顯示,大小約5000 bp和1100 bp,符合預(yù)期,表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖1)。

圖1 重組質(zhì)粒pET28a-SUMO-EgACT酶切鑒定圖Figure 1 Themap of recombinant p lasm id pET28a-SUMO-EgACT digestion identification

2.2 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化結(jié)果

誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果表明,EgACT蛋白在20℃和37℃沉積物中具有可見帶(圖2)。利用鎳瓊脂凝膠親和色譜法進(jìn)行蛋白質(zhì)純化,EgACT蛋白在500 mM咪唑濃度時,被大量洗脫下來(圖3)。

圖2 pET28a-SUMO-EgACT表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析圖Figure 2 Expression products of pET-28a-SUMO-EgACT w ith SDS-PAGE analysis

圖3 鎳瓊脂糖親和層析SDS-PAGE分析圖Figure 3 NickelSepharose Affinity Chrom atography w ith SDS-PAGE Analysis

2.3 重組蛋白最終純化SDS-PAGE分析結(jié)果

SDS-PAGE分析顯示,EgACT在約60 kD處出現(xiàn)明顯特異條帶,與理論值一致,獲得純度較高的純化目的蛋白(圖4)。

圖4 重組蛋白EgACT的SDS-PAGE分析圖Figure 4 Recom binant protein EgACTanalyzed w ith SDS-PAGE

2.4 重組蛋白EgACT蛋白濃度測定結(jié)果

使用SK3071非干擾型蛋白定量試劑盒測量EgACT蛋白濃度：1.27 mg/mL(圖 5,表 1)。

圖5 蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Figure 5 Standard curve of protein concentration

表1 純化蛋白濃度測定結(jié)果表Table 1.Results of purified protein concentration measurement

3 討論

細(xì)粒棘球蚴病,又稱囊性包蟲病。由于棘球蚴病感染早期無任何臨床癥狀,所以在臨床上很難做到早發(fā)現(xiàn)、早治療。因此,近年來,探索高靈敏性、高特異性的早期診斷指標(biāo)成為防治包蟲病的迫切期待。隨著基因工程技術(shù)及免疫學(xué)技術(shù)等的日益發(fā)展,為包蟲病的早期診斷研究提供了發(fā)展平臺,進(jìn)而為實現(xiàn)包蟲病早期診斷提供了可能。

細(xì)粒棘球蚴病作為一種嚴(yán)重的人畜共患病,其感染分兩個階段。一是以幼蟲形式或包蟲囊腫形式在中間宿主(如人類或家畜、野生草食類動物)的內(nèi)臟中發(fā)育;二是成蟲在終宿主(如犬類)的小腸中生長。在這些發(fā)育階段,寄生蟲的細(xì)胞形態(tài)和生理特性發(fā)生著顯著變化[7]。肌動蛋白作為細(xì)胞分化和增殖過程中的關(guān)鍵分子之一,在所有真核細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)了肌動蛋白基因[8],在細(xì)粒棘球絳蟲基因組中也發(fā)現(xiàn)了幾個肌動蛋白基因[9]。原頭蚴蛋白質(zhì)中細(xì)胞骨架蛋白占據(jù)了重要部分,可維持細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)并與細(xì)胞運動有關(guān)。其中肌動蛋白作為細(xì)胞骨架蛋白的重要組分,是微絲的結(jié)構(gòu)蛋白,參與細(xì)胞形態(tài)的維持、運動調(diào)節(jié)及細(xì)胞與各組分之間的相互作用[10,11]。在肌細(xì)胞中,細(xì)胞的運動離不開肌動蛋白和肌球蛋白的共同作用。

基于以上性質(zhì),蟲體的運動可能與肌動蛋白有關(guān)[12]?；谝陨贤茰y,將EgACT作為免疫抗原。

通過上述設(shè)計,成功構(gòu)建了PET28a-EgACT重組質(zhì)粒,獲得了純化蛋白。后續(xù)將繼續(xù)對肌動蛋白對于細(xì)粒棘球蚴病的免疫學(xué)特性進(jìn)行分析,構(gòu)建免疫動物模型,了解EgACT刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的能力。