曹 峰 耿冬青 周志杰

濟(jì)南市第二食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心 山東濟(jì)南 271100

萊蕪黑豬(萊蕪豬)是我國(guó)優(yōu)良的地方品種，2006年被農(nóng)業(yè)部列為國(guó)家級(jí)畜禽遺傳資源保護(hù)品種，具有肉質(zhì)細(xì)嫩多汁、香味濃郁等優(yōu)良特性[1]。萊蕪黑豬肉營(yíng)養(yǎng)豐富，肌內(nèi)脂肪含量、肌肉鮮味氨基酸、必需氨基酸等均高于普通豬肉[2]，此外黑豬肉中的維生素含量較高，尤以煙酸較多。煙酸(Nicotinic acid)也稱維生素B3、尼克酸，是人體必需的13種維生素之一。煙酸在人體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為煙酰胺，參與體內(nèi)脂質(zhì)代謝，組織呼吸的氧化過(guò)程[3]。煙酸還具有抑制動(dòng)脈粥樣硬化[4]，保護(hù)人臍內(nèi)皮細(xì)胞，維護(hù)血管結(jié)構(gòu)及功能等作用[5]。人體若缺乏煙酸，可產(chǎn)生糙皮病。此外，煙酸常添加在豬肉等肉類(lèi)產(chǎn)品中，以保持肉的色澤鮮艷，然而攝入過(guò)量的煙酸會(huì)引起充血癥，如臉紅，皮膚騷癢，頭痛等癥狀[6]。因此，準(zhǔn)確快速測(cè)定煙酸含量對(duì)提高萊蕪黑豬肉的品質(zhì)及確保食品安全具有重要意義。

目前煙酸的檢測(cè)方法有高效液相色譜法[7]、微生物法[8]、紫外分光光度法[9]、毛細(xì)管電泳法[10]，超臨界流體色譜法[11]等，其中高效液相色譜法是較常用的方法，具有靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。測(cè)定食品中煙酸的前處理方法多采用酸水解法[3,6]，由于黑豬肉水解后將產(chǎn)生大量的水溶性蛋白，這些蛋白進(jìn)入色譜柱后，很難被洗脫下來(lái)，不但影響分析效果，還會(huì)縮短色譜柱的使用壽命[12]。針對(duì)此問(wèn)題，本文參照相關(guān)研究[13]并加以改進(jìn)，采用20%甲醇水溶液作為提取液，經(jīng)超聲提取，較好地解決了這一問(wèn)題，大大降低了對(duì)色譜柱的損害，并對(duì)高效液相色譜法進(jìn)行了改進(jìn)優(yōu)化，可以簡(jiǎn)單、快速、精確測(cè)定萊蕪黑豬肉中的煙酸含量。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Ultimate3000高效液相色譜儀(配紫外/可見(jiàn)光檢測(cè)器)，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；

TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器股份有限公司；

KQ-800KED高功率數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器有限公司；

2-16KL高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)SIGMA公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

煙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%)，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；

甲醇(色譜純)，默克股份兩合公司；

磷酸二氫鉀(優(yōu)級(jí)純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱(150×4.6mm，5.0μm)。

流動(dòng)相：甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(5∶95，V/V)。

流速：1mL/min。

柱溫：30℃。

紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)：261nm，進(jìn)樣量20μL。

1.3 樣品處理

稱取20g萊蕪黑豬肉(瘦肉)樣品，放于均質(zhì)器中并加入20%甲醇溶液20mL，研磨成漿并混合均勻，然后稱取2g(精確至0.001g)勻漿試樣至50mL塑料離心管中，加入20mL20%甲醇，渦旋混勻后放入超聲波清洗器中超聲提取60min，再以6 000r/min離心15min，將全部上清液移入容量瓶中，用20%甲醇定容至50mL，經(jīng)0.22μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾后待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)的選擇

將煙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描，以確定煙酸的最大吸收波長(zhǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖1所示。

掃描光譜圖可以顯示煙酸在波長(zhǎng)261nm處有最大吸收，與國(guó)標(biāo)方法[14]相同，為保證該方法的靈敏度及穩(wěn)定性，選擇261nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

本研究在流動(dòng)相組成及比例不同的條件下，根據(jù)保留時(shí)間與色譜峰分離情況等，來(lái)確定適合的流動(dòng)相組成及比例。參照相關(guān)文獻(xiàn)[14～19]，本研究同時(shí)驗(yàn)證了甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液、甲醇-異丙醇-庚烷磺酸鈉、甲醇-0.004mol/L庚烷磺酸鈉-冰醋酸、乙腈-0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液4種不同流動(dòng)相體系，結(jié)果表明以甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液與乙腈-0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液為流動(dòng)相時(shí)目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰能很好分離，由于甲醇毒性較小，因此選用甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液作為流動(dòng)相。

將甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液分別在體積比為5∶95、10∶90及15∶85的條件下對(duì)煙酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在體積比為5∶95時(shí)煙酸出峰時(shí)間為3min左右，煙酸色譜峰峰形好，且能與雜質(zhì)峰完全分離，甲醇的體積比提高到10%及15%后，煙酸色譜峰的保留時(shí)間縮短，但與雜質(zhì)峰無(wú)法完全分離，因此本研究選擇甲醇與0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液的比例為5∶95(V/V)。

2.1.3 色譜柱柱溫的確定

色譜柱的分離效果受柱溫影響較為顯著，溫度升高，柱壓下降，保留時(shí)間縮短。由于煙酸比較耐熱[3]，是理化性質(zhì)最穩(wěn)定的一種維生素[19]，為提高檢測(cè)精密度，縮短分析時(shí)間，柱溫選擇30℃。

2.1.4 煙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及萊蕪黑豬肉色譜圖

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)分析確定的色譜條件，煙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液及萊蕪黑豬肉樣品色譜圖見(jiàn)圖2、圖3。

2.2 煙酸的線性和檢出限

將煙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋?zhuān)渲瞥?個(gè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液并在優(yōu)化的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，得到煙酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=37 900X+6 550(Y，峰面積；X，濃度)，相關(guān)系數(shù)R=0.9998，曲線的RSD為1.67%，結(jié)果表明煙酸在1.0～25.0mg/L范圍內(nèi)濃度和峰面積線性關(guān)系良好，在此條件下煙酸的檢出限(以信噪比為3∶1時(shí)煙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液的濃度為本方法檢出限)為2.0×10-4g/kg，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖4。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

萊蕪黑豬肉樣品按1.3方法處理后，在優(yōu)化的色譜條件下對(duì)黑豬肉樣品平行測(cè)定6次，計(jì)算樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

從表1可以看出，連續(xù)6次平行測(cè)定的萊蕪黑豬肉樣品中煙酸含量，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.62%，表明該方法精密度良好，滿足要求。

2.4 樣品加標(biāo)回收率的測(cè)定

稱取適量黑豬肉樣品，分別加入0.50、1.00、5.00、10.00、20.00mg/L的煙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，依照1.3所述將樣品處理，測(cè)定6次，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加標(biāo)回收結(jié)果(n=6)

表中結(jié)果顯示，在1.2的測(cè)試條件下黑豬肉中煙酸的加標(biāo)回收率為96.5%～103.8%，平均加標(biāo)回收率為98.4%，回收率的RSD為2.76%，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

本方法以甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(5∶95，V/V)為流動(dòng)相，采用紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)為261nm，煙酸在1.0～25.0mg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系(R=0.9998)，精密度實(shí)驗(yàn)表明其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.62%(n=6)，平均加標(biāo)回收率為98.4%，檢出限為2.0×10-4g/kg，萊蕪黑豬肉樣品中煙酸的平均含量為6.21mg/100g，結(jié)果顯示該方法可準(zhǔn)確快速測(cè)定萊蕪黑豬肉等肉品中的煙酸含量。