,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林長春 130118;2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,吉林長春 136100)

轉(zhuǎn)基因作物與傳統(tǒng)作物相比,具有抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量高等特點,為解決當(dāng)前世界“糧食危機(jī)”作出了貢獻(xiàn)[1-2];草甘膦(glyphosate)又稱農(nóng)達(dá),是一種低毒廣譜除草劑[3]。從土壤農(nóng)桿菌株CP4中分離得到抗草甘膦基因Epsps,其編碼的CP4-EPSPS蛋白對草甘膦具有高抗性而被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因大豆,使大豆過量表達(dá)EPSPS蛋白,賦予大豆草甘膦抗性[4-5]。目前,轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因抗除草劑大豆是世界上種植面積最大的轉(zhuǎn)基因作物[6],我國是世界上最大的大豆進(jìn)口國,每年都要從美國、巴西、阿根廷等國進(jìn)口大量的轉(zhuǎn)基因大豆[7]。隨著轉(zhuǎn)基因作物種類的增加及其產(chǎn)品的大規(guī)模商業(yè)化,使得人們對轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的安全性產(chǎn)生一定的質(zhì)疑[8],監(jiān)管部門、企事業(yè)單位、科研單位和消費者對轉(zhuǎn)基因檢測產(chǎn)品提出更高的要求。因此,建立一種快速轉(zhuǎn)基因大豆及其產(chǎn)品的鑒定方法是十分必要的[6-8]。

我國目前對轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆的檢測技術(shù)主要分為兩大類,基于外源核酸成分和外源蛋白靶標(biāo)的檢測技術(shù)。目前,檢測效果最直觀的是對基因編碼的外源蛋白進(jìn)行檢測[9-12]。酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)是基于外源蛋白檢測的常規(guī)檢測方法,它具有操作簡便、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、靈敏度高、耗時短、成本低等特點[13-16]。由于該方法對檢測環(huán)境、操作方法等要求低,所以適合基層廣泛推廣應(yīng)用[17-19]。

本研究利用表達(dá)純化的CP4-EPSPS可溶性蛋白免疫BALB/c小鼠和綿羊,制備鼠單克隆抗體和羊多克隆抗體,并建立CP4-EPSPS蛋白雙抗夾心ELISA檢測方法。通過對該方法工作條件的優(yōu)化,提高該檢測方法的準(zhǔn)確性及靈敏度,以期為CP4-EPSPS蛋白定量檢測試劑盒的開發(fā)提供一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PAT蛋白、Cp4 epsps工程表達(dá)菌株 本實驗室保存;6～8周齡BALB/c小鼠 遼寧省實驗動物資源中心;Cp4 epsps轉(zhuǎn)基因大豆、非轉(zhuǎn)基因大豆 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所;弗氏佐劑、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記兔抗小鼠IgG和兔抗綿羊IgG Sigma公司;脫脂奶粉、硫酸卡那霉素 生工生物工程(上海)股份有限公司;Ni-NTA-瓊脂糖親和層析柱 上海意弘生物科技有限公司;抗體親和介質(zhì)Protein G Sepharose 4Fast Flow 上海羽朵生物科技有限公司;雙組分TMB顯色液、DAB顯色試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒 北京索萊寶科技有限公司。

CO2恒溫培養(yǎng)箱 日本三洋公司;EL-X800酶標(biāo)儀 美國BIO-RAD儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 CP4-EPSPS蛋白純化 復(fù)蘇實驗室保存的Cp4 epsps表達(dá)菌,用LB液體培養(yǎng)基(含終濃度為50 ng/mL的硫酸卡那霉素)37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6,加入終濃度為1 mmol/L的IPTG,搖床180 r/min,37 ℃誘導(dǎo)4 h;誘導(dǎo)后菌體用PBS重懸3次,超聲波破碎菌懸液,12000 r/min離心20 min,取上清經(jīng)Ni-NTA-瓊脂糖親和層析柱純化后獲得可溶性CP4-EPSPS蛋白[20],SDS-PAGE分析蛋白純化效果[20],BCA蛋白試劑盒對其定量。

1.2.2 CP4-EPSPS單克隆抗體的制備 單克隆抗體的制備參照文獻(xiàn)[20]的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。將純化的CP4-EPSPS蛋白與弗氏佐劑混合,以100 μg/只經(jīng)肌肉注射免疫BALB/c小鼠,兩周免疫1次,免疫3次,在細(xì)胞融合前3 d加強(qiáng)免疫1次,200 μg/只。以重組蛋白CP4-EPSPS和轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆葉片粗提物為抗原,篩選CP4-EPSPS特異性單克隆抗體。Protein G柱純化制備的單抗[21],SDS-PAGE分析抗體純化效果[22],BCA蛋白試劑盒對其定量。

1.2.3 CP4-EPSPS多克隆抗體的制備 將純化后的可溶性CP4-EPSPS蛋白與弗氏佐劑混合肌肉多點注射免疫3只綿羊,兩周免疫一次,2 mg/只。免疫3次后頸靜脈采血,4 ℃,4000 r/min離心30 min,分離血清[22]。Protein G柱純化羊抗血清,SDS-PAGE分析抗體純度,BCA蛋白試劑盒測定純化后抗體濃度。

1.2.4 Western blot分析抗體特異性 純化的CP4-EPSPS蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,以制備的鼠單抗和羊多抗為一抗(1∶5000稀釋),HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG和兔抗綿羊IgG為二抗(1∶10000稀釋),對抗體的特異性進(jìn)行Western blot分析。

1.2.5 雙抗夾心ELISA方法的建立 將制備的單抗包被96孔酶標(biāo)板,100 μL/孔,4 ℃靜置過夜;加入5%脫脂奶250 μL/孔,37 ℃封閉30 min;加待測抗原100 μL/孔,20 ℃,靜置孵育1 h;加檢測抗體100 μL/孔,20 ℃,靜置孵育1 h,以上每一步操作結(jié)束后PBST洗滌3遍;TMB顯色液90 μL/孔,避光顯色30 min;2 mol/L H2SO4溶液45 μL/孔,終止反應(yīng);酶標(biāo)儀測定OD450處吸光度值。根據(jù)公式:OD450待測抗原(P值)/OD450陰性抗原(N值)≥2.1判定檢測結(jié)果為陽性。

以上實驗重復(fù)3次，同時設(shè)置陽性、陰性、空白(陽性為CP4-EPSPS蛋白;陰性為PAT蛋白;空白為去離子水)3個對照。

1.2.6 雙抗夾心ELISA工作條件的優(yōu)化 檢測抗體的篩選:采用間接ELISA對制備的3份CP4-EPSPS蛋白羊抗血清進(jìn)行效價檢測,以免疫前羊血清為陰性血清,包被1 μg/mL CP4-EPSPS蛋白,一抗為倍比稀釋的羊血清,二抗為HRP標(biāo)記的兔抗綿羊IgG,選擇效價最高的羊多抗血清為檢測抗體,并由南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司進(jìn)行HRP標(biāo)記。

捕獲抗體的篩選:運用雙抗夾心ELISA方法對5株單克隆抗體進(jìn)行篩選,以制備的5株CP4-EPSPS單克隆抗體分別為作為捕獲抗體,包被96孔酶標(biāo)板,HRP標(biāo)記的多抗為檢測抗體,待測抗原20 ℃靜置孵育15 min,選擇P/N最大值對應(yīng)的單抗為捕獲抗體。

抗體工作濃度優(yōu)化:通過矩陣滴定法[20]確定捕獲抗體和檢測抗體的最佳工作濃度?？乖⒖贵w孵育條件優(yōu)化:運用雙抗夾心ELISA方法分別優(yōu)化捕獲抗體、抗原及檢測抗體的孵育條件,以P/N最大值確定最佳孵育條件[23-24]。

1.2.8 重復(fù)性試驗 分別采集4份轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆葉片和籽粒,用10倍體積PBS緩沖液研磨,12000 r/min離心5 min,取上清,運用建立的雙抗夾心ELISA方法檢測,每份材料3個平行,根據(jù)P/N值計算出板內(nèi)、板間標(biāo)準(zhǔn)差及其變異系數(shù)[26]。

1.2.9 檢測轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因抗除草劑大豆 采集轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆結(jié)莢期的根、莖、葉、種子各10份,每個樣品3個重復(fù),用10倍體積PBS緩沖液研磨,12000 r/min離心5 min,取上清,運用建立的雙抗夾心ELISA方法檢測CP4-EPSPS蛋白表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用 Excel 2010對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行初步分析并繪制相關(guān)圖形。顯著性差異分析采用SPSS 23.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 CP4-EPSPS蛋白的SDS-PAGE分析

利用Ni-NTA-瓊脂糖親和層析柱對可溶性表達(dá)的CP4-EPSPS蛋白進(jìn)行純化,如圖1所示,在49 kDa處有清晰的蛋白條帶。

圖1 CP4-EPSPS蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of CP4-EPSPS protein注:M:Marker;1～4:Ni-Native-100緩沖液依次洗脫下的4管CP4-EPSPS蛋白。

2.2 CP4-EPSPS蛋白抗體特異性分析

本研究共制備了5株單抗,分別為1D10、2D3、6A6、10H4、1D12,3份多抗分別為8092、7040、7038。如圖2所示,抗體經(jīng)Protein G柱純化,SDS-PAGE顯示有兩條帶,分別為免疫球蛋白G(IgG)的輕鏈(25 kDa)和重鏈(50 kDa)。由Western blot分析(如圖3),5株單抗和3份多抗均能特異性識別CP4-EPSPS蛋白。

圖2 抗CP4-EPSPS抗體純化的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of purification of anti-CP4-EPSPS antibody注:M:Marker;1D10、2D3、6A6、10H4、1D12:單抗;7038、7040、8092:多抗。

圖3 抗CP4-EPSPS抗體特異性Western blot鑒定Fig.3 Identification of anti-CP4-EPSPS antibody specific Western blot注:M:Marker;陰:為PAT蛋白;陽:CP4-EPSPS蛋白1D10、2D3、6A6、10H4、1D12:均為單抗;8092、7040、7038:均為多抗。

2.3 CP4-EPSPS蛋白雙抗夾心ELISA檢測方法的建立

對3份羊多抗血清效價進(jìn)行測定,如圖4所示,3只羊中,8092效價最高,效價為128000,因此,確定其為檢測抗體。運用雙抗夾心ELISA篩選捕獲抗體,如表1所示,5株單克隆抗體中MAb 1D12 P/N值最大,表明MAb 1D12與多抗8092配對效果最佳,確定1D12為捕獲抗體。采用矩陣滴定法篩選抗體的工作濃度,如表2所示,選擇捕獲抗體工作濃度為1.25 μg/mL,檢測抗體工作濃度為2.5 μg/mL時為最優(yōu)組合,在該工作濃度下,顯色反應(yīng)明顯,陰性背景值低。對捕獲抗體、抗原及檢測抗體孵育條件進(jìn)行優(yōu)化,如圖5、圖6所示,捕獲抗體4 ℃包被過夜、抗原20 ℃孵育45 min、檢測抗體20 ℃孵育30 min時,P/N值最大,說明在該工作條件下,建立的CP4-EPSPS蛋白雙抗夾心ELISA檢測方法效果最佳。

表1 捕獲抗體的確定Table 1 Determination of capture antibody

表2 抗體最佳工作濃度確定Table 2 Determination of optimum working concentration of antibody

圖4 多克隆抗體效價測定Fig.4 Detection of the titer of PAbs against CP4-EPSPS

圖5 捕獲抗體孵育時間對檢測結(jié)果的影響Fig.5 Effect of capture antibody incubation time on the results of detection

圖6 抗原和檢測抗體孵育時間對檢測結(jié)果的影響Fig.6 Effect of antigen incubation time and detection antibody incubation time on test results

2.4 雙抗夾心ELISA法的靈敏度

圖7 雙抗夾心ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 The standard curve of double antibody sandwich ELISA注：a:ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線;b:檢測線。

2.5 重復(fù)性實驗結(jié)果

如表3所示,對8份樣品檢測,板內(nèi)變異系數(shù)為0.92%～7.98%,板間變異系數(shù)為2.09%～7.39%,均小于15%,表明建立的雙抗夾心ELISA方法的重復(fù)性效果良好。

表3 重復(fù)性試驗結(jié)果Table 3 Results of repetitive experiment

2.6 檢測轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因抗除草劑大豆

本研究對轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆材料的不同組織部位進(jìn)行定量檢測,表4數(shù)據(jù)顯示,CP4-EPSPS蛋白在葉片中表達(dá)量最高,含量最高的為ZL-1大豆,平均達(dá)到306.118±3.976 μg/g,蛋白在同一大豆植株的莖、種子、根中表達(dá)量依次降低,且顯著低于葉片表達(dá)量。不同大豆在同一組織部位蛋白表達(dá)量也存在差異,例如,蛋白在莖中表達(dá)量最高的是ZL-10大豆,平均達(dá)到230.252±4.081 μg/g,表達(dá)量最低的是ZL-7大豆,平均達(dá)到101.328±15.344 μg/g,表達(dá)量相差129 μg/g。綜上所述,CP4-EPSPS蛋白在大豆植株內(nèi)各部位均有表達(dá),且表達(dá)量差異顯著。

表4 大豆植株不同組織中CP4-EPSPS蛋白表達(dá)量(μg/g)Table 4 Expression of CP4-EPSPS protein in different tissues of soybean plants(μg/g)

3 結(jié)論與討論

本研究成功建立了CP4-EPSPS蛋白雙抗夾心ELISA定量檢測方法,該方法最低檢測限為3.6 ng/mL,檢測范圍為7.5～125 ng/mL;重復(fù)性變異系數(shù)小于15%。利用該方法定量檢測轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆的根、莖、葉和種子,發(fā)現(xiàn)CP4-EPSPS蛋白在根、莖、葉、種子中均有表達(dá),且表達(dá)量存在差異。

本研究建立的檢測方法中待測抗原及檢測抗體的孵育溫度均為20 ℃,在實際運用中,與同種類型的試劑盒相比,降低了對檢測環(huán)境及設(shè)備的要求,同時,該檢測方法中的檢測抗體經(jīng)HRP標(biāo)記,簡化了操作步驟,縮短了檢測時間[27]。

目前,部分學(xué)者用2株單抗建立雙抗夾心ELISA[28],本研究中用單抗和多抗建立雙抗夾心ELISA,是因為CP4-EPSPS蛋白有多個抗原表位,單抗可以特異性識別并結(jié)合CP4-EPSPS蛋白上的一個抗原表位,有利于捕獲抗原,而多抗可以識別并結(jié)合CP4-EPSPS蛋白上多個抗原表位,有助于放大檢測信號;如選擇單抗作為檢測抗體,單抗識別的抗原表位可能被多抗占據(jù),導(dǎo)致檢測信號降低[23]。

目前,科研、海關(guān)、食品監(jiān)督等部門對轉(zhuǎn)基因生物的檢測需求日益增多。所以建立一套轉(zhuǎn)基因作物檢測體系十分重要,本研究建立的CP4-EPSPS蛋白雙抗夾心ELISA檢測方法能夠快速準(zhǔn)確地定量檢測轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因抗除草劑大豆,為開發(fā)CP4-EPSPS蛋白檢測試劑盒和試紙條提供基礎(chǔ),同時為我國轉(zhuǎn)基因檢測的發(fā)展和我國轉(zhuǎn)基因作物的推廣研究提供技術(shù)支持。