,*

(1.西華大學食品與生物工程學院,四川省食品生物技術(shù)重點實驗室,四川成都 610039;2.西華大學古法發(fā)酵(釀造)生物技術(shù)研究所,四川成都 610039;3.四川國檢檢測有限責任公司,四川瀘州 646000;4.中國科學院成都生物研究所,四川成都 610041)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是廣泛存在于植物、動物和微生物中的一種非蛋白質(zhì)氨基酸[1]。在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,GABA是一種重要的抑制性遞質(zhì),具有精神安定、降血壓、抗焦慮等功效[2]。因此,GABA被廣泛應用于食品、醫(yī)藥及保健品等行業(yè)[3]。目前,合成GABA的方法主要有化學合成法、植物富集法和微生物發(fā)酵合成法,相比而言,微生物發(fā)酵合成法具有周期短、安全性好、耗能低等優(yōu)點,所以微生物發(fā)酵合成法成為了當前研究的熱點[4]。然而,優(yōu)良菌株的缺乏制約了微生物發(fā)酵合成GABA的進一步發(fā)展,因此獲取優(yōu)良菌株成為了采用微生物發(fā)酵法合成GABA的首要任務。

傳統(tǒng)發(fā)酵制品中功能性微生物的篩選一直是關(guān)注的重點,其中泡菜是以乳酸菌為主要發(fā)酵微生物的傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜,口感清爽、味道鮮美、質(zhì)地脆嫩、營養(yǎng)豐富,深受消費者喜愛[5],也是獲得功能性微生物的重要來源。曾林等[6]對四川泡菜中產(chǎn)GABA乳酸菌進行篩選,得到12株乳桿菌屬菌株;劉文麗等[7]從泡菜中篩選出1株產(chǎn)GABA短乳桿菌PD1-2。但報道乳酸菌多為短乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌等,而對于產(chǎn)GABA屎腸球菌及提高其產(chǎn)量的研究鮮有報道[8-9]。目前,提高GABA產(chǎn)量的方法主要有理化誘變處理、重組基因構(gòu)建、生物催化合成等[10],其中通過優(yōu)化培養(yǎng)條件進一步提高GABA合成量一直是研究熱點。Song等[11]對發(fā)酵紅小豆奶中產(chǎn)GABA培養(yǎng)基進行優(yōu)化,產(chǎn)量為1.12 g/L;Tung等[12]通過響應面優(yōu)化設計對植物乳桿菌進行分析,優(yōu)化培養(yǎng)條件后GABA產(chǎn)量為0.629 g/L。不同種類或不同來源的微生物對GABA的合成條件存在差異性,因此有必要對微生物合成GABA的影響因素進行分析和研究,從而尋求一種提高GABA微生物合成量的途徑。

本研究以四川泡菜為分離源,篩選鑒定產(chǎn)GABA的屎腸球菌;利用響應面分析法對屎腸球菌生物合成GABA參數(shù)進行優(yōu)化,以確定該菌株的最佳發(fā)酵合成GABA的條件。同時對其益生特性進行分析。本研究旨在為產(chǎn)GABA的功能性菌株開發(fā)應用以及產(chǎn)GABA發(fā)酵條件優(yōu)化等相關(guān)研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

泡菜液 成都郫都區(qū)紅光農(nóng)貿(mào)市場,樣品采集后立即進行微生物分離純化;大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞 美國Promega公司;丹磺酰氯(DNS-Cl,含量≥98%) 成都華夏化學試劑有限公司;γ-氨基丁酸(GABA,含量≥99%) 上海金穗生物科技有限公司;L-谷氨酸鈉(L-MSG,含量≥98.5%)、茚三酮、膽固醇、豬膽鹽等其他試劑為分析純級試劑 成都市科龍化工試劑廠。

720BR電泳凝膠成像分析儀 BIO-RAD(美國);T-1 Thermoblock PCR自動擴增儀 Biometra Tgradient(美國);994超低溫冰箱 Thermo Fisher Scientific(美國);DYY-8C電泳儀 北京六一生物科技有限公司(中國);Waters2695高效液相色譜儀 Waters(美國);島津-GL INERTSIL ODS-3(4.6 mm×150 mm,5 μm)色譜柱 島津公司(日本);WFJ-7200酶標儀 上海閃譜生物科技有限公司(中國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 MRS液體培養(yǎng)基:葡萄糖20 g,蛋白胨10 g,牛肉膏10 g,酵母粉5 g,乙酸鈉5 g,磷酸二氫鉀2 g,檸檬酸銨2 g,吐溫80 1 mL,硫酸鎂0.5 g,硫酸錳0.25 g,蒸餾水1 L,pH6.2,121 ℃滅菌15 min,備用。在上述培養(yǎng)基中添加2%(w/V)瓊脂制成MRS固體培養(yǎng)基。

改良MRS培養(yǎng)基:含有0.5% L-谷氨酸鈉的MRS液體培養(yǎng)基。

MRS-Oxgall-CHOL 液體培養(yǎng)基:MRS液體培養(yǎng)基中加入已過濾除菌的水溶性膽固醇(100 μg/mL)。

1.2.2 微生物的分離純化 取泡菜樣液25 mL,加入225 mL無菌生理鹽水(0.85%)混勻制成菌懸液。菌液10倍梯度稀釋后取適宜濃度涂布于MRS固體培養(yǎng)基,37 ℃倒置培養(yǎng)12 h。挑取單菌落劃線純化3次后加入甘油于-50 ℃冰箱保種,備用。

1.2.3 菌株生化特征分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 參考《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[15]、《伯杰氏細菌手冊》中的實驗方法進行生化測試分析乳酸菌的種屬特性,鑒定到種或亞種。分別對目標菌株進行革蘭氏染色、不同溫度和pH條件下的生長耐受、耐鹽性、糖發(fā)酵和抗生素敏感性實驗等生理生化分析。同時對菌株DNA進行提取,采用16S rRNA克隆和測序鑒定,所得結(jié)果于GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對,并用MEGA5.0軟件中的Neighbor-Joining法進行1000次步長計算構(gòu)建發(fā)育樹。

1.2.4 GABA表達能力評估 采用高效液相色譜法(HPLC)定量檢測GABA含量[13]。參考Komatsuzaki等[14]方法,對發(fā)酵液進行衍生化。HPLC分析條件:柱溫30 ℃;紫外檢測波長為254 nm;進樣量10 μL;流動相A為甲醇,流動相B為醋酸鈉(pH6.2)-甲醇-四氫呋喃(84∶25∶1,V/V/V);流速1 mL/min;洗脫方式:線性梯度洗脫,流動相A比例為:0～6 min,20%～50%;6～9 min,50%～80%;9～10 min,80%～100%;10～11 min,100%;11～15 min,20%。

1.2.5 乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)GABA的單因素實驗 反應體系為改良MRS培養(yǎng)基、接種量2%的前提條件下,在發(fā)酵溫度34 ℃、初始pH6.5條件下靜置培養(yǎng)72 h,考察不同底物濃度(2、3、4、5、6 g/L)對GABA產(chǎn)量和生長情況(OD600)的影響。在底物濃度5 g/L、初始pH6.5條件下靜置培養(yǎng)72 h,考察不同發(fā)酵溫度(30、32、34、36、38 ℃)對GABA產(chǎn)量和生長情況(OD600)的影響。在底物濃度5 g/L、發(fā)酵溫度34 ℃條件下靜置培養(yǎng)72 h,考察不同初始pH(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)對GABA產(chǎn)量和生長情況(OD600)的影響。在底物濃度5 g/L、發(fā)酵溫度34 ℃、初始pH6.5條件下,考察不同發(fā)酵時間(24、36、48、60、72、84 h)對GABA產(chǎn)量和生長情況(OD600)的影響。

1.2.6 響應面優(yōu)化試驗設計 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選取相應的響應面設計中心點,以GABA產(chǎn)量為評價指標,利用Design-Expert 8.0軟件設計4因素3水平Box-Behnken響應面試驗。對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析,確定菌株產(chǎn)GABA的最佳條件,因素水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment

1.2.7 益生特性分析

1.2.7.1 耐酸分析 將菌株37 ℃培養(yǎng)直至菌體濃度達到1×108CFU/mL,以2%的接種量分別接入pH2.0、2.5、3.0、3.5的MRS液體培養(yǎng)基中,30 ℃靜止培養(yǎng)12 h后,按照現(xiàn)行有效的國家標準(GB 4789.2-2016)[16]活菌計數(shù),計算存活率。

式中:N1為經(jīng)過耐酸性處理后存活的活菌菌落數(shù);N0為pH6.86空白MRS液態(tài)培養(yǎng)基處理的活菌菌落數(shù)。

1.2.7.2 耐膽鹽分析 取菌體濃度達到1×108CFU/mL的菌株按接種量2%分別接種到含0(即空白對照)、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 g/L膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中,30 ℃靜置培養(yǎng)12 h后菌落計數(shù)[17]。

1.2.7.3 降膽固醇能力分析 分別配置2、5、10、12、15、20 μg/mL膽固醇酒精溶液與MRS液體培養(yǎng)基的混合物,參照Maryam等[18]的鄰苯二甲醛法測定上清液中膽固醇含量,繪制膽固醇含量標準曲線為 Y=0.0152X+0.1063(R2為0.9977),可用于降膽固醇能力評價。按2%(V/V)接種量將菌株接種入10 mL滅菌MRS-Oxgall-CHOL培養(yǎng)基(液體)中,30 ℃培養(yǎng)12 h,同時以未接種菌株培養(yǎng)基的吸光值為對照,根據(jù)標準曲線換算出菌株膽固醇清除量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用IBM SPSS statistics 20統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(ANOVA)和多重比較(LSD:最小顯著差數(shù)法),柱狀圖Origin 8.0進行繪制。每組實驗三個平行,所有結(jié)果用平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選鑒定

從四川泡菜中共篩選得到7株產(chǎn)GABA菌株,其產(chǎn)量范圍在0.21～1.08 g/L,其中菌株AB157 GABA產(chǎn)量最高(1.08 g/L),選作后續(xù)研究菌株。將菌株AB157接種于MRS固體培養(yǎng)基中,菌落邊緣整齊、乳白色、有光澤,革蘭氏染色陽性(圖1);根據(jù)生理生化特征(表2),初步認為菌株AB157屬于腸球菌屬。結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明(圖2),該菌株基因序列與基因庫中屎腸球菌(Enterococcusfaecium)的相似性為99%。根據(jù)種分類定義,該分類單位的16S rRNA序列同源性大于97%[19],并結(jié)合形態(tài)學、生理生化實驗結(jié)果,確定該菌株為屎腸球菌。

表2 生理生化實驗結(jié)果Table 2 Results of physiological and biochemical test

圖1 菌株AB157的菌體形態(tài)Fig.1 Mycelial morphology of strain AB157A:菌落形態(tài);B:顯微形態(tài)(100×)。

圖2 基于菌株AB157 16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain AB157 based on 16S rRNA gene sequences

2.2 單因素對屎腸球菌AB157生長及GABA產(chǎn)量的影響

微生物發(fā)酵過程中會產(chǎn)生谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD),該酶催化谷氨酸脫羧為GABA,考慮成本和穩(wěn)定性，通常選用L-谷氨酸鈉作為發(fā)酵底物。屎腸球菌AB157發(fā)酵體系中選取了不同質(zhì)量濃度的谷氨酸鈉(圖3A),L-MSG添加量為5 g/L時,生成的GABA濃度達到最大,為1.24 g/L,底物濃度繼續(xù)增大其GABA生成率降低。Komatsuzaki等[20]研究表明,適當?shù)奶岣咔绑w物質(zhì)L-MSG,在一定程度上有利于轉(zhuǎn)向產(chǎn)物GABA的生成,但是當?shù)孜餄舛却笥?00 mmol/L時,繼續(xù)增加谷氨酸鈉的濃度GABA的生成反而降低,同時,菌體濃度也隨之減小?？赡苡捎谶^高的底物增加了細胞的滲透壓,影響了菌體的生長,從而導致代謝減弱。

圖3 L-谷氨酸鈉濃度、發(fā)酵溫度、初始pH和發(fā)酵時間對菌株AB157生長及GABA產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of L-glutamic acid concentration,temperature,initial pH and fermentation time on the growth of E. faecium AB157 and the yield of GABA

發(fā)酵溫度對屎腸球菌AB157的生長及GABA產(chǎn)量的影響見圖3B。結(jié)果表明,隨著溫度的升高,GABA濃度呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢,在32 ℃達到最大值為1.32 g/L,菌體濃度趨勢與之一致,因此選取32 ℃為最適溫度。溫度主要影響微生物體內(nèi)酶的催化作用,不同的酶具有不同最適溫度,高溫或者低溫都會影響酶的活力,從而影響菌體的生長。

培養(yǎng)基的pH是微生物發(fā)酵過程中一個重要的參數(shù),通過影響電荷,從而影響了酶活力,進一步影響菌體的生長以及代謝的積累。Zhao等[21]研究表明在GABA的合成階段,需要大量的消耗H+,從而導致pH有所上升,但是當發(fā)酵過程中pH超過7.0時,GABA的合成會終止。此外,也有報道通過控制發(fā)酵過程的pH在4.0～6.0之間[22-23],提高GABA的質(zhì)量濃度。不同pH對GABA合成的影響結(jié)果見圖3C。結(jié)果表明當pH為6.5時更有助于GABA的生成,其含量為1.19 g/L。鄭鴻雁等[22]選用假絲酵母菌初始pH為4.5合成GABA量最高;李理等[23]探索植物乳桿菌在初始pH為4.65時產(chǎn)GABA能力最強;而Yang等[24]篩選的鳥腸球菌起始pH為6.5時生成的GABA含量最大。因此不同菌株之間起始pH對產(chǎn)GABA的含量影響不同。

微生物生長過程中產(chǎn)生初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物,GABA的合成與菌體的生命活動無明確功能,因此GABA被認為是一種次級代謝產(chǎn)物[25]。發(fā)酵時間與GABA合成關(guān)系見圖3D,隨著時間的延長GABA呈現(xiàn)上升趨勢,菌體濃度先增加后降低。在發(fā)酵前期菌體用于生長繁殖,在48～72 h時GABA大量積累,而72 h后產(chǎn)量增加緩慢,這可能是由于營養(yǎng)物缺乏導致細胞衰亡,從而使GABA合成減緩。因此,選取72 h作為最優(yōu)發(fā)酵時間。

2.3 Box-Behnken響應面試驗結(jié)果

表3 響應面試驗設計方案與響應值Table 3 Treatment incorporations and responses of response surface methodology

由回歸方程所做的響應面立體圖和相應等高線圖如圖4所示,其在交互項中,L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度與pH(AC)、L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度與發(fā)酵時間(AD)、發(fā)酵溫度與pH(BC)對GABA產(chǎn)量的影響極顯著(P<0.01),初始pH與發(fā)酵時間(CD)對GABA產(chǎn)量的影響顯著,其他因素之間交互影響不顯著。

表4 響應面設計的回歸方程系數(shù)顯著性檢驗及方差分析Table 4 Analysis of statistical significance of each regression coefficient and variance for the experimental results of RSM design

圖4 各因素交互作用對GABA質(zhì)量濃度的響應面及等高線Fig.4 Response surface and contour plots for the interactive effects of three factors on the concentration of GABA

2.4 響應面模型的驗證和優(yōu)化

根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果,在對應變量最佳值為L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度5.15 g/L、發(fā)酵溫度31.2 ℃、pH7和發(fā)酵時間68.34 h,得到最大GABA產(chǎn)量預測值為1.64 g/L時,進一步對模型預測值進行驗證,并根據(jù)實際情況進行變量的選擇,設置L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度為5.2 g/L、發(fā)酵溫度31 ℃、初始pH為7、發(fā)酵時間70 h,此時GABA產(chǎn)量為1.60 g/L,與預測值擬合度達97.56%,表明優(yōu)化模型合理可靠。此外,屎腸球菌AB157產(chǎn)GABA能力優(yōu)于Lu等[26]報道從中國泡菜中篩選的短乳桿菌(1005.81 mmol/L)、Somkuti等[27]報道從酸奶中獲得的嗜熱鏈球菌(0.0067 g/L)和Park等[28]從韓國泡菜中獲得的短乳桿菌(8 mmol/L)產(chǎn)GABA能力。

2.5 屎腸球菌AB157的益生特性分析

屎腸球菌AB157的耐酸實驗結(jié)果見圖5A,在pH2.0時存活率為39%,pH3.0為82%,pH3.5達到97%。通常人體胃部pH維持在3.0～5.0之間[29],由耐酸分析可知,該菌對酸性環(huán)境具有良好的耐受性。

屎腸球菌AB157對不同質(zhì)量濃度梯度的膽鹽耐受進行分析,結(jié)果見圖5B。人體內(nèi)膽鹽的濃度一般為0.3～3 g/L[30],由圖5B可知,隨著膽鹽濃度的升高,菌株AB157的存活率逐漸降低,在膽鹽濃度3 g/L時存活率為59%。表明該菌株對高濃度膽鹽具有一定的耐受性。

圖5 屎腸球菌AB157耐酸和耐膽鹽實驗Fig.5 Acid and bile salt test for E. faecium AB157

為進一步考察屎腸球菌AB157的潛在益生特性,對其膽固醇降解能力進行分析。經(jīng)標曲計算,屎腸球菌AB157膽固醇脫除量為18.09 μg/mL(對應吸光值的均值為0.381)。培養(yǎng)基中的膽固醇含量減少可能是由于菌株同化膽固醇的作用[31]。據(jù)于志會[32]報道,商業(yè)菌株LactobacillurhamnosusGG的膽固醇脫除量為14.84 μg/mL,表明屎腸球菌AB157具有較強的降解膽固醇能力。

3 結(jié)論

從四川泡菜中分離得到一株高產(chǎn)GABA菌株AB157,通過生理生化和分子生物學鑒定為屎腸球菌(Enterococcusfaecium)。在單因素實驗基礎(chǔ)上,采用響應面法對屎腸球菌AB157發(fā)酵合成GABA條件優(yōu)化,得到最佳條件為L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度5.2 g/L、發(fā)酵溫度31 ℃、初始pH7和發(fā)酵時間70 h,在此優(yōu)化條件,GABA產(chǎn)量達到1.60 g/L。同時,屎腸球菌AB157具有良好的酸、膽鹽耐受性和膽固醇降解能力等潛在益生特性,可作為潛在優(yōu)質(zhì)功能性微生物資源。