,*

(1.寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江寧波 315800;2.浙江省動(dòng)物蛋白食品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江寧波 315800)

迷迭香酸(Rosmarinicacid,簡(jiǎn)稱RA)是天然的水溶性酚酸類化合物,首先由兩位意大利化學(xué)家從迷迭香(Rosmarinusofficialis)中分離出來(lái)[1-2],是咖啡酸和3,4-二羥基苯基乳酸由酯鍵相連形成的二聚體,其廣泛分布于各類藥用植物中,尤其是紫草科和唇形科植物[3]。ε-聚賴氨酸(ε-Polylysine,簡(jiǎn)稱ε-PL)是天然的食品防腐劑,由25～30個(gè)L-賴氨酸殘基組成,于1977年被Shima和Sakai從土壤中分離出來(lái)[4]。ε-聚賴氨酸具有廣譜抗菌作用(AMP),能抑制酵母菌、真菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、噬菌體,可以作為新型抗生素抑制微生物,在日本已經(jīng)被列入食品添加劑的清單[5]。而金黃色葡萄球菌作為一種常見(jiàn)的食源性腸道致病菌廣泛地存在于自然界中,適宜環(huán)境下可產(chǎn)生腸毒素,人誤食感染金黃色葡萄球菌食物會(huì)導(dǎo)致嘔吐、腹痛等癥狀[6]。合理利用抑菌劑可以降低金黃色葡萄球菌帶菌率,減少此類食源性疾病的發(fā)生。

近年來(lái),迷迭香酸由于抗病毒、抗氧化、抗炎癥等諸多生物學(xué)活性,使其在功能食品、香料、調(diào)味品、日用化工等領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用,還可作為食品中潛在的植物化學(xué)補(bǔ)充劑和降糖劑[7-8]。ε-聚賴氨酸于2014年被列入我國(guó)食品添加劑的行列,可作為焙烤食品、熟肉制品、果蔬汁類的防腐劑[9]。目前研究表明迷迭香酸和ε-聚賴氨酸均有廣譜抗菌作用,能抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌,兩者均對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用,前者對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌抑制效果更明顯[8]。而抗生素濫用會(huì)導(dǎo)致耐藥性細(xì)菌頻繁出現(xiàn)[10],國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)迷迭香酸和ε-聚賴氨酸的研究多集中于其各自生物學(xué)活性和應(yīng)用上,對(duì)兩者聯(lián)合使用抑菌效果尚未報(bào)道。

本研究旨在評(píng)估迷迭香酸和ε-聚賴氨酸聯(lián)合使用及單獨(dú)使用迷迭香酸或ε-聚賴氨酸的抑菌效果,并根據(jù)這兩種抑菌成分對(duì)金黃色葡萄球菌的協(xié)同作用,得到最低抑菌濃度指數(shù),降低其使用劑量,從而最大程度地減少這些抗菌成分可能存在的潛在毒副作用,進(jìn)而將這兩種抑菌成分的復(fù)合物廣泛地應(yīng)用于食品領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens) 寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏菌種;迷迭香酸(≥97%)、ε-聚賴氨酸(MW<5000) 麥克林試劑公司(中國(guó));LB肉湯培養(yǎng)基(配方:胰蛋白胨10.0 g,酵母提取物5.0 g,氯化鈉10.0 g,pH7.0±0.2,加水定容至1 L)、LA瓊脂培養(yǎng)基(配方:牛肉膏1.0 g,酵母膏2.0 g,蛋白胨5.0 g,NaCl 5.0 g,瓊脂15.0 g,pH7.4,加水定容至1 L) 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;SDS-PAGE變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒、還原糖含量檢測(cè)試劑盒 北京索萊寶科技有限公司;Brandford法蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒 上海生工生物工程股份有限公司。

AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;LDZF-50L-П型立式高壓蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療機(jī)械廠;SW-CJ-2D超凈工作臺(tái) 蘇州華科凈化設(shè)備有限公司;QHZ-12A組合式恒溫震蕩培養(yǎng)箱 寧波江南儀器制造廠;Eppendorf centrifuge 5418R 德國(guó)Eppendorf公司;Infinnite200pro酶標(biāo)儀 瑞士TECAN公司;梯度PCR儀 寧波歐普儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抑菌劑的配制和菌種的活化純化 參照Liu等[10]和Balakrishnan等[11]實(shí)驗(yàn)方法,用純水將迷迭香酸(RA)和ε-聚賴氨酸(ε-PL)配成質(zhì)量濃度分別為16和3 mg/mL的母液,用0.22 μm的無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌,4 ℃冰箱冷藏備用。

將實(shí)驗(yàn)室保藏的菌種接種至100 mL的LB肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃ 150 r/min震蕩培養(yǎng)10 h,再于固體瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線,劃線后的平板在37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h。用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落接種至無(wú)菌肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃ 150 r/min震蕩培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)6～8 h,菌液離心并用生理鹽水沖洗2～3次,保存于30%甘油中,-40 ℃冰箱凍存。每次使用時(shí)取200 μL接種至100 mL的滅菌LB肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)6～8 h后,通過(guò)稀釋調(diào)節(jié)濃度至105～106CFU/mL。

1.2.2 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 采用肉湯稀釋法[11],將迷迭香酸和ε-聚賴氨酸用無(wú)菌LB肉湯分別二倍稀釋成一定濃度梯度(8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL和1.5、0.75、0.375、0.1875、0.09375 mg/mL)。每個(gè)濃度抑菌液中接種2%(V/V)活化后的菌液105CFU/mL,置于37 ℃ 150 r/min的恒溫培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)24 h,以不加抑菌液為空白對(duì)照。用肉眼觀察是否有沉淀物,600 nm吸光度檢測(cè),得到兩種抑菌成分的MIC值,重復(fù)測(cè)定三次[12]。

1.2.3 棋盤(pán)法檢測(cè)RA和ε-pL的聯(lián)合抑菌效果 棋盤(pán)法:參照周亞濱[13]的方法,依賴于各抑菌成分單獨(dú)使用時(shí)的最小抑菌濃度(MIC)為基礎(chǔ),在96孔細(xì)胞板上將抑菌劑按不同方向二倍稀釋,進(jìn)行交叉配合。1～10列每孔依次加入二倍梯度稀釋的迷迭香酸溶液50 μL,A～F行每孔加入二倍梯度稀釋的ε-聚賴氨酸溶液50 μL,第11列每孔中ε-聚賴氨酸梯度濃度溶液作為對(duì)照,第G行每孔中加入迷迭香酸梯度濃度溶液作為對(duì)照,每孔中加入菌液(105CFU/mL)100 μL,混合均勻,于37 ℃ 150 r/min培養(yǎng)18 h,觀察是否有肉眼可見(jiàn)菌,實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定三次。FICI(Fractional inhibitory concentration index),即抑菌濃度指數(shù)[14]。

結(jié)果評(píng)價(jià)[15]:FICI≤0.5,協(xié)同作用(synergy);FICI≥4,拮抗作用(antagonism);其他情況均為無(wú)相互作用(no interaction)。

1.2.4 抑菌動(dòng)力學(xué)曲線 參照Liu等[10]的實(shí)驗(yàn)方法,采用液體培養(yǎng)法來(lái)測(cè)定。于96孔板上每孔加入100 μL菌懸液(105CFU/mL)和100 μL的抑菌劑,混合均勻后置于37 ℃、150 r/min的恒溫培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng),每隔2 h測(cè)定620 nm處吸光度,連續(xù)測(cè)定24 h。以不加抑菌劑的菌液作為對(duì)照,實(shí)驗(yàn)做三組平行。抑菌動(dòng)力學(xué)的公式為:

式中：A0為對(duì)照組的吸光度,A為實(shí)驗(yàn)組的吸光度。

1.2.5 迷迭香酸和ε-聚賴氨酸的抑菌圈直徑 通過(guò)牛津杯法來(lái)測(cè)定抑菌圈,參照Wang等[16]研究方法加以修改。培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液經(jīng)過(guò)稀釋,使其菌落數(shù)約為105CFU/mL,吸取100 μL該稀釋的菌液涂布于瓊脂平板上,并將牛津杯放置于瓊脂平板表面,分別加入200 μL的MICRA、2MICRA、MICε-PL、2MICε-PL、1/4MICRA+1/4MICε-PL、1/2MICRA+1/2MICε-PL,對(duì)照組加入等量的無(wú)菌蒸餾水。在4 ℃條件下靜置擴(kuò)散6 h后,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,再測(cè)定抑菌圈直徑,每組實(shí)驗(yàn)平行做三次。

1.2.6 迷迭香酸和ε-聚賴氨酸對(duì)細(xì)菌還原性糖和可溶性蛋白的影響 還原糖含量的測(cè)定參照崔凱宇[17]方法:取活化后的菌液1 mL接種到100 mL滅菌LB肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃ 150 r/min震蕩培養(yǎng)4 h后菌液離心,重懸于無(wú)菌肉湯培養(yǎng)基中,調(diào)節(jié)菌液濃度約為108CFU/mL,用此菌懸液稀釋RA的濃度為MICRA,ε-PL的濃度為MICε-PL,以及RA和ε-PL協(xié)同抑菌濃度,以不加抑菌劑的菌懸液做空白對(duì)照。實(shí)驗(yàn)參照還原糖含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū),分別提取2、4、6 h的上述培養(yǎng)液1 mL,3000 r/min離心10 min后去上清,菌沉淀參照還原糖試劑盒測(cè)定540 nm處的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)還原糖溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原糖含量,實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

可溶性蛋白含量的測(cè)定[18]:取上述實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)2、4、6 h的菌液各1 mL,5000 r/min離心10 min后取上清液[19],按照Brandford法[20]于595 nm處測(cè)吸光度,用標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,可溶性蛋白含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定蛋白含量,實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)三次。

1.2.7 迷迭香酸和ε-聚賴氨酸對(duì)菌表層蛋白的影響 參照Hamza等[14]實(shí)驗(yàn)方法,表層蛋白:將1.2.6中添加了抑菌劑的菌懸液于37 ℃ 150 r/min混合培養(yǎng)6 h后,離心(5000 r/min,10 min)后棄上清。菌沉淀重懸于1 mol/L LiCl中,重懸液體積占1/10,在42 ℃ 180 r/min搖床中震蕩處理2 h,取部分上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析[21]。

電泳:將上述樣品與等體積蛋白上樣緩沖液[22]混合后,沸水浴5 min,趁熱上樣,每孔10 μL。凝膠制備:15%分離膠(distilled water 2.4 mL,30% Acr-Bis(29∶1)5.0 mL,Gel buffer A 2.5 mL,10% APS 0.1 mL,TEMED 0.006 mL),5%濃縮膠(distilled water 1.0 mL,30% Acr-Bis(29∶1)0.5 mL,Gel buffer B 1.5 mL,10% APS 0.03 mL,TEMED 0.003 mL)。電泳跑膠電壓先80 V,后120 V,2 h。電泳完畢,將凝膠與考馬斯亮藍(lán)R250染色液微波爐加熱染色6～8 min后脫色1 h,觀察結(jié)果并拍膠。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)處理重復(fù)三次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 21軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)ANOVA分析,通過(guò)OriginLab OriginPro 8.5軟件(美國(guó)Origin Lab公司)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 迷迭香酸與ε-聚賴氨酸對(duì)金黃色葡萄球菌的協(xié)同抑制作用

根據(jù)孫峋等[23]研究發(fā)現(xiàn),迷迭香酸對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用明顯大于大腸桿菌,而本試驗(yàn)如表1所示,迷迭香酸對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果也明顯高于其他試驗(yàn)菌。又因ε-聚賴氨酸對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用,所以采用棋盤(pán)法將兩種抑菌劑進(jìn)行聯(lián)合作用實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明迷迭香酸和ε-聚賴氨酸在對(duì)金黃色葡萄球菌的相互作用的試驗(yàn)中表現(xiàn)出協(xié)同作用,協(xié)同指數(shù)為0.5。為迷迭香酸和ε-聚賴氨酸聯(lián)合抑菌實(shí)驗(yàn)確定了抑制濃度,即1 mg/mL RA+0.0469 mg/mL ε-PL。李永波等[24]研究發(fā)現(xiàn),迷迭香酸超過(guò)一定濃度時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌、腸桿菌屬、沙門(mén)氏菌均有顯著的抑菌效力,且對(duì)常見(jiàn)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌有廣譜抑菌作用。這與本試驗(yàn)迷迭香酸對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有抑制作用相符,且驗(yàn)證了迷迭香酸對(duì)金黃色葡萄球菌較大腸桿菌抑制作用更強(qiáng)這一特性。

表1 迷迭香酸與ε-聚賴氨酸對(duì)金黃色葡萄球菌的協(xié)同抑制作用Table 1 Synergistic inhibitory effect of rosmarinic acid and ε-polylysine on Staphylococcus aureus

2.2 迷迭香酸和ε-聚賴氨酸對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌直徑的影響

如表2所示,迷迭香酸和ε-聚賴氨酸無(wú)論是單獨(dú)還是聯(lián)合使用,隨著濃度的增大對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑都會(huì)增大,但是1/4MICRA+1/4MICε-PL對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果相當(dāng)于2MICε-PL,可見(jiàn)迷迭香酸和ε-聚賴氨酸的協(xié)同效果明顯。

表2 迷迭香酸與ε-聚賴氨酸對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌直徑的影響Table 2 Effects of rosmarinic acid and ε-polylysine on inhibition zone of Staphylococcus aureus

2.3 抑菌動(dòng)力學(xué)曲線

由圖1可知,迷迭香酸和ε-聚賴氨酸在20 h內(nèi)隨著時(shí)間延長(zhǎng)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用逐漸增強(qiáng),兩者最小抑菌濃度的抑菌強(qiáng)度相當(dāng),而1/4最小抑菌濃度的迷迭香酸和ε-聚賴氨酸的聯(lián)合使用同1/4最小抑菌濃度的迷迭香酸和1/4最小抑菌濃度的ε-聚賴氨酸各自使用抑菌效果相當(dāng),表明聯(lián)合使用抑菌劑可以降低各抑菌劑的濃度和使用量。Liu等[10]研究得出ε-聚賴氨酸和Nisin協(xié)同作用,可以大大降低這兩種抑菌劑的抑菌濃度。

圖1 抑菌動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 Antibacterial dynamics of the antimicrobials注:抑菌劑濃度分別為:4 mg/mL RA、0.1875 mg/mLε-PL、1 mg/mL RA+0.0469 mg/mL ε-PL。

2.4 金黃色葡萄球菌胞內(nèi)還原性糖含量的變化

如圖2所示,隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),在抑菌劑的作用下,金黃色葡萄球菌胞內(nèi)還原糖泄漏量明顯大于對(duì)照組。在6 h的處理時(shí)間內(nèi),對(duì)照組中的還原糖基本沒(méi)有泄漏量,而處理組中的還原糖泄漏量隨著時(shí)間的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì),且ε-聚賴氨酸的作用效果強(qiáng)于迷迭香酸,兩種抑菌成分協(xié)同作用可以增強(qiáng)迷迭香酸的抑菌效果。結(jié)果表明,ε-聚賴氨酸可以顯著(P<0.05)破壞金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜,其與迷迭香酸聯(lián)合使用也可顯著(P<0.05)促進(jìn)菌體內(nèi)還原糖的泄漏,隨著處理時(shí)間的增加而增加。

圖2 抑菌劑對(duì)金黃色葡萄球菌中還原性糖含量的影響Fig.2 Effects of antibiotics on the reducing sugar from Staphylococcus aureus cells注:抑菌劑濃度分別為:4 mg/mL RA、0.1875 mg/mLε-PL、1 mg/mL RA+0.0469 mg/mL ε-PL、未加抑菌劑CS。

2.5 金黃色葡萄球菌胞內(nèi)可溶性蛋白泄漏的情況

如圖3所示,未添加任何抑菌劑的對(duì)照組,金黃色葡萄球菌上清液的可溶性蛋白含量隨著時(shí)間的增長(zhǎng)基本沒(méi)有變化,而實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比均導(dǎo)致上清液可溶性蛋白含量增加,實(shí)驗(yàn)組中添加MIC迷迭香酸的導(dǎo)致菌可溶性蛋白泄漏量最多,其次是添加1/4MIC RA+1/4MIC ε-PL,最后是加入MIC ε-聚賴氨酸。在2～6 h隨著時(shí)間的增長(zhǎng),添加RA和1/4MIC RA+1/4MIC ε-PL的這兩組,可溶性蛋白逐漸增多,第8 h蛋白有少部分降解。加入ε-PL的這組在2～4 h間隔,可溶性蛋白有部分降解,而4～8 h又逐漸增多,說(shuō)明這兩種抑菌成分以及兩種抑菌成分的結(jié)合能增加細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性,導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白物質(zhì)泄漏。蔡曉軍等[19]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),迷迭香中的1,8-桉葉素可以破壞沙門(mén)氏菌的細(xì)胞膜,導(dǎo)致菌的蛋白質(zhì)發(fā)生泄漏。

圖3 抑菌劑對(duì)金黃色葡萄球菌菌液中可溶性蛋白含量的影響Fig.3 Effects of antibiotics on soluble proteins from Staphylococcus aureus注:抑菌劑濃度分別為:4 mg/mL RA、0.1875 mg/mLε-PL、1 mg/mL RA+0.0469 mg/mL ε-PL、未加抑菌劑 CS；不同小寫(xiě)字母表示同一處理方式不同時(shí)間數(shù)據(jù)差異顯著,P<0.05。

2.6 金黃色葡萄球菌表層蛋白的SDS-PAGE電泳分析

由圖4可知,與對(duì)照組相比在抑菌劑的作用下,金黃色葡萄球菌的表層蛋白分子表達(dá)發(fā)生了不同的變化。細(xì)菌表面膜蛋白中含有多種毒力因子,MSCRAMMs是最主要的毒力因子,其包括金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)中的聚集因子A(ClfA)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)中的SdrG,以及其他金黃色葡萄球菌中類似膠原結(jié)合蛋白成分[25]。文華等[26]研究金黃色葡萄球菌在抑菌劑作用下,菌蛋白凝膠電泳圖譜中出現(xiàn)了幾條變化的蛋白條帶,表明抑菌劑抑制了金黃色葡萄球菌可溶性蛋白的表達(dá)。添加迷迭香酸實(shí)驗(yàn)組中的金黃色葡萄球菌與對(duì)照組相比,相應(yīng)的蛋白分子消失;添加ε-聚賴氨酸實(shí)驗(yàn)組中的金黃色葡萄球菌與對(duì)照相比出現(xiàn)其他小分子的蛋白,這也表明了迷迭香酸和ε-聚賴氨酸能抑制金黃色葡萄球菌可溶性蛋白的表達(dá),從而抑制了菌表面毒力因子的毒性,表明RA和ε-PL對(duì)金黃色葡萄球菌的MSCRAMMs有抑制作用。

圖4 抑菌劑對(duì)金黃色葡萄球菌表層蛋白的影響Fig.4 Effects of antibiotics on the surface layer proteins from Staphylococcus aureus注:泳道1:4 mg/mL RA、泳道2:0.1875 mg/mL ε-PL、泳道3:1 mg/mL RA+0.0469 mg/mL ε-PL、泳道4:不加抑菌劑、泳道5,6,7,8分別為前四者的上清液。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)表明迷迭香酸和ε-聚賴氨酸對(duì)金黃色葡萄球菌均有抑制作用,但是迷迭香酸的最小抑菌濃度值(MIC)較高,兩種抑菌劑協(xié)同作用可以降低迷迭香酸的用量,即1 mg/mL 迷迭香酸+0.0469 mg/mL ε-聚賴氨酸的復(fù)合抑菌劑。迷迭香酸和ε-聚賴氨酸的復(fù)合對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而增強(qiáng),蛋白泄漏量和還原糖的泄漏也隨著作用時(shí)間的增長(zhǎng)而增加,這表明兩種抑菌成分可以破壞金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜,促使菌胞內(nèi)蛋白和還原糖的泄漏。同時(shí)其可能抑制或降低了金黃色葡萄球菌MSCRAMMs的蛋白毒性,從而對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用,為以后研究這兩種抑菌成分協(xié)同抗菌作用機(jī)制提供了一定的參考依據(jù)。