(南昌大學科學技術(shù)學院,江西南昌 330029)

丙烯酰胺(Acrylamide,AA)是由富含淀粉類的食物和天冬酰胺在高溫下進行化學反應(yīng)生成的一種有毒副產(chǎn)物,是熱加工食品中重要的內(nèi)源性污染物之一,進入人體的AA約有90%會被代謝,僅少部分(<10%)會以原形從尿中排出[1],AA毒性在有機體的累積會誘導產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)與肝損傷現(xiàn)象,姜麗平等[2]研究發(fā)現(xiàn),高濃度的丙烯酰胺毒性累積會增加細胞內(nèi)的活性氧(ROS)的水平,ROS對蛋白質(zhì)、細胞膜脂質(zhì)的連續(xù)攻擊所造成的相關(guān)靶分子累計氧化損傷,會造成細胞代謝紊亂和功能異常,引起肝組織損傷現(xiàn)象。

黑果枸杞(學名:LyciumruthenicumMurr.)為茄科、枸杞屬,主要分布于中國陜西北部、寧夏、甘肅等地,成熟干燥時食用。黑枸杞含有多種氨基酸、多糖、黃酮類化合物等。枸杞多糖是黑枸杞的有效藥物成分,其多糖含量為9.92%[3]。黑果枸杞中酸性多糖的含量高于紅果枸杞,中性多糖含量無顯著性差異,兩種枸杞中多糖結(jié)構(gòu)基本相似[4]。黑枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharide,LBP)作為一種天然的抗氧化劑具有增強肝臟抗氧化、抑制炎癥反應(yīng)、清除自由基等抗氧化功能[5-6]。據(jù)文獻報道天然的食品抗氧化劑可以有效消弱AA在機體內(nèi)的毒性效果,有良好的調(diào)節(jié)保護作用。趙巖[7]通過實驗研究發(fā)現(xiàn)枸杞多糖能降低糖尿病大鼠早期腎臟系數(shù)和血清尿素氮、肌酐水平,升高血清及腎組織 SOD、CAT、GSH-Px活性和降低丙二醛(MDA)水平;賈東升等[8]研究發(fā)現(xiàn)LBP能提高肝纖維化大鼠肝臟中SOD、GSH-Px和GSH的活性,并顯著降低MDA的含量。曹軍等[9]研究證實姜黃素能明顯抑制丙烯酰胺毒性引起的細胞ROS水平升高;陳冬妍等[10]研究表明大蒜素對丙烯酰胺和環(huán)氧丙烯酰胺毒性導致的組織和細胞氧化損傷具有較強的保護作用;Zhao等[11]研究證實藍莓花青素可通過防止氧化應(yīng)激的反應(yīng)來提供對抗丙烯酰胺毒性誘導的線粒體損傷。黑枸杞多糖是天然的抗氧化資源之一,本研究旨在探索黑枸杞多糖對AA致大鼠肝損傷,為在食品中作為防護AA毒性第二道屏障的膳食補充劑提供一種新的天然抗氧化劑來源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清潔級大鼠(Sprague Dawley SD) 70只,體質(zhì)量(180±10) g,6周齡,雌雄各半,由南昌大學醫(yī)學院實驗動物中心提供,實驗動物許可證號:SYXK(贛)2015-0003;黑果枸杞 產(chǎn)自甘肅定西,經(jīng)鑒定為茄科植物黑果枸杞的成熟干燥果實;黑枸杞多糖 由本實驗室提取純化,經(jīng)鑒定為黑枸杞多糖,純度為99%;MDA、CAT、SOD、GSH-Px試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所;AST、ALT試劑盒 南京建成生物工程研究所;葡萄糖標準品(純度≥99%) 上?？郎锟萍加邢薰?。

GT10-1型高速臺式離心機 廣東佛衡儀器有限公司公司;EU-2800DS紫外可見光分光光度計 上海昂拉儀器有限公司;Thermo多功能酶標儀 山東博科科學儀器公司;SZ-93雙蒸水儀 上海亞榮生化儀器廠;N-110-D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市瑞德儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑枸杞多糖的制備 取黑枸杞干燥粉末5.0 g,80%乙醇前處理,按照提取溫度為90 ℃,液料比為30∶1,取時間為2 h,水提液濃縮后,加入氯仿/正丁醇=5∶1試劑,充分震蕩離心6次,95%乙醇溶液攪拌,冷藏過夜,離心,70%乙醇洗滌,減壓干燥得黑枸杞多糖[12-14]。

1.2.2 動物分組和給藥 健康成年大鼠70只,體質(zhì)量(180±10) g,在12 h明暗循環(huán)動物飼養(yǎng)房內(nèi)適應(yīng)性生活一周。將大鼠隨機分為7組,每組10只,雌雄各半,正常進食飲水條件下進行灌胃給藥:AA染毒模型組(AA,灌胃AA水溶液20 mg/kg bw)、陽性對照組(NAC+AA,灌胃NAC水溶液200 mg/kg bw)、毒性抑制組(黑枸杞多糖低、中、高劑量組,分別灌胃黑枸杞多糖50 mg/kg bw(LBPL+AA)、100 mg/kg bw(LBPM+AA)、150 mg/kg bw(LBPH+AA))、高劑量多糖組(LBPH,灌胃黑枸杞多糖200 mg/kg bw)、正常對照組(CT,給予同等體積生理鹽水),前五組每天灌胃丙烯酰胺水溶液半小時后,所有組別大鼠給予相對應(yīng)的藥物,連續(xù)給藥飼喂4周。實驗前和實驗中每周對大鼠進行稱重,記錄給藥期間大鼠體重的變化,結(jié)束給藥后進行各類相關(guān)指標測定。

1.2.3 大鼠肝組織中氧化指標的測定 末次給藥后1 h后,每組隨機取5只大鼠,頸椎脫臼處死,迅速取其肝臟置于冰浴上,剔除結(jié)締組織,取0.5 g加預冷的生理鹽水研磨,制成10%的組織勻漿液,4 ℃、4000 r/min離心15 min,取其上清液備用。按試劑盒說明書,測定大鼠肝臟中 MDA、CAT、SOD 和 GSH-Px的活力。

1.2.4 大鼠血清中肝損傷指標的測定 末次灌胃給藥24 h 后,每組隨機取5只大鼠,摘除眼球取血,室溫待血清分層后,4 ℃、4000 r/min離心,取上層血清,4 ℃?zhèn)溆?。參照試劑盒說明書,檢定大鼠血清中 ALT、AST 水平。

1.2.5 大鼠肝臟組織形態(tài)檢測 末次給藥后24 h后,每組隨機取5只大鼠,頸椎脫臼處死,迅速取出肝臟,在距肝大葉邊緣處橫切5 mm×5 mm×5 mm塊狀肝組織,生理鹽水沖洗后,波恩固定液中固定,梯度酒精脫水、透蠟、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色,制作成病理切片,顯微鏡觀察肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果分析

2.1 丙烯酰胺毒性對大鼠生長的影響

AA連續(xù)染毒4周后,與CT組相比較,AA染毒組大鼠精神明顯變差,進食、活動量明顯減少;攝入不同劑量LBP及NAC各組大鼠的活動量、進食量得到不同程度的改善。AA染毒各時期大鼠體重變化見表1:染毒7～28 d,與CT組比較AA染毒組體重均顯著降低(P<0.05);染毒21、28 d后,與AA染毒組相比較,攝入不同濃度的LBP實驗組與NAC陽性對照組大鼠體重都得到顯著改善(P<0.05);與正常對照組相比較,LBPH組體重沒有表現(xiàn)出明顯差異。說明黑枸杞多糖對大鼠體重無副作用,且對丙烯酰胺造成機體體重損失起到明顯的緩解效果。

表1 各組大鼠體重變化(n=10,g)Table 1 The changes for rats body weight(n=10,g)

2.2 大鼠肝組織中氧化指標的測定結(jié)果

黑枸杞多糖對AA致大鼠肝組織中抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性的影響如表2所示。與CT組相比,AA組大鼠肝組織細胞內(nèi)抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的活力均呈顯著性降低(P<0.05);與AA染毒組相比較,LBP+AA各組和NAC+AA組細胞中抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的活力均有顯著性提高(P<0.05),尤其是LBPM+AA組對肝細胞中抗氧化酶GSH-Px活力的提高效果優(yōu)于NAC+AA組;LBPH單獨處理組細胞中抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px與CT組相比較,數(shù)據(jù)沒有明顯的差異,這說明黑枸杞多糖單獨處理時,對機體的抗氧化防御系統(tǒng)無損傷,對機體無毒害作用,且黑枸杞多糖能改善AA所致的肝損傷。

黑枸杞多糖對AA致大鼠肝組織中抗氧化酶MDA活性的影響如表2所示:與CT組相比較,AA染毒組中過氧化物MDA含量顯著增高(P<0.05),與AA組相比較,NAC+AA組和LBP+AA各組肝組織中MDA均顯著性降低(P<0.05)。這說明不同濃度的黑枸杞多糖均能夠降低機體內(nèi)MDA的含量,并且隨著黑枸杞多糖濃度的升高,機體內(nèi)MDA含量逐漸降低,具有濃度依賴性。

表2 黑枸杞多糖對肝損傷大鼠組織中氧化指標的影響(n=10,g)Table 2 Effects of LBP on biochemical parameters in hepatic damage rat(n=10,g)

2.3 大鼠肝損傷指標的測定結(jié)果

黑枸杞多糖對AA致大鼠肝損傷指標如表3數(shù)據(jù)所示,與CT組相比較,AA組肝組織中AST、ALT的含量表現(xiàn)出顯著性升高(P<0.05),說明灌胃AA可引起大鼠肝細胞損傷;與AA染毒模型組相比較,NAC+AA組和LBP+AA保護組各組AST、ALT含量均顯著降低(P<0.05);在黑枸杞多糖組中,尤其以100 mg/kg多糖組對肝組織的AST、ALT含量的降低效果顯著,顯著優(yōu)于陽性對照組(P<0.05);與CT組相比較,LBPH組肝細胞中ALT的含量無明顯差異。表明不同濃度黑枸杞多糖對丙烯酰胺造成機體AST、ALT含量的升高具有明顯的減弱作用。

表3 黑枸杞多糖對大鼠肝損傷指標的影響(n=10,g)Table 3 Effects of LBP on rat in hepatic damage(n=10,g)

2.4 大鼠肝組織病理學形態(tài)觀察

黑枸杞多糖對AA致大鼠肝組織損傷見圖1,CT組大鼠肝組織形態(tài)正常,肝小葉結(jié)構(gòu)完整,無細胞破裂、自溶或壞死等現(xiàn)象。與CT組相比,AA染毒組肝組織出現(xiàn)嚴重病變,炎細胞浸潤現(xiàn)象嚴重,肝小葉排列紊亂,肝細胞腫脹嚴重,出現(xiàn)成片壞死現(xiàn)象,胞漿稀松,肝細胞之間邊緣界限模糊;與AA染毒組病理圖片相比,NAC+AA組和LP+AA各組肝組織病變情況得到很好的改善,各組肝細胞沒有明顯的病例癥狀,肝細胞排列正常,細胞邊緣界限清楚,細胞結(jié)構(gòu)完整。

圖1 黑枸杞多糖對AA致肝損傷的大鼠肝組織形態(tài)學變化的影響(100×)Fig.1 Effects of LBP on liver histological changes of AA induced in rats(100×)注:A.CT組;B. AA組;C. NAC+AA組;D. LBPL+AA組;E. LBPM+AA組;F. LBPH+AA組;G. LBPH組。部分肝細胞腫脹,炎癥細胞浸潤(橢圓),膠原纖維形成(箭頭)。

3 討論

大量研究表明[15-18],肝臟具有較強的抗氧化防御機制,各種抗氧化酶:如SOD1、Catalase 1、谷胱甘肽過氧化酶(GPX)和維生素C、E,以及谷胱甘肽等,脂質(zhì)氧化產(chǎn)物與肝臟疾病存在一定的聯(lián)系。在機體防御系統(tǒng)中,抗氧化酶CAT、SOD的高低可以反映該組織中超氧陰離子的清除能力,GSH-Px可以清除由活性氧(ROS)引起的脂質(zhì)過氧化物酶,保護細胞膜功能和結(jié)構(gòu)的完整性[19],而MDA的含量增加或減少可以直接反映過氧化的程度或者間接反映氧化應(yīng)激所導致的損傷程度[20]。有研究結(jié)果顯示[21],高劑量黑果枸的補充可有效降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶,提高機體SOD含量,從而對大鼠運動性心肌損傷引起的心肌脂質(zhì)過氧化起到阻止作用。汪建紅等[22]研究發(fā)現(xiàn),黑枸杞多糖可以增強糖尿病小鼠血清和肝臟SOD活性,降低其血清和肝臟MDA含量,并能促進葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)楦翁窃?。本研究的結(jié)果顯示:攝入黑枸杞多糖可以有效減少過氧化MDA的含量,說明機體脂質(zhì)過氧化得到了控制,這與汪建紅的研究結(jié)果一致;同時組織中GSH-Px、SOD、CAT的含量也有不同程度的提高,這與于月媛[23]研究結(jié)果一致,說明黑枸杞多糖可以提高機體在氧化應(yīng)激中的總抗氧化能力,由此可推測出,黑枸杞多糖對丙烯酰胺誘導的大鼠肝損傷的保護機制與其抗氧化性有關(guān)。

AA誘導的肝損傷大鼠血清中ALT、AST活性顯著高于空白組,LBP+AA各組均能顯著降低AA誘導的大鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶的含量,其中高劑量組LBP比低劑量組效果更好;肝組織病理切片形態(tài)學結(jié)果進一步證實了LBP對AA致大鼠肝損傷的緩解作用,LBP+AA各組組織切片中,肝細胞的腫脹、變形明顯減輕,炎癥得到有效控制,肝小葉的排列,細胞之間的界限模糊都得到了有效控制,表明黑枸杞多糖能有效緩解AA誘導的大鼠肝損傷。一定濃度的AA毒性累積會導致細胞內(nèi)ROS的增加,ROS對蛋白質(zhì)和細胞膜脂質(zhì)與DNA的連續(xù)性攻擊,會導致肝細胞膜受損,ALT、AST主要分布于肝細胞胞漿內(nèi),肝細胞受損后,細胞膜通透性增加,血清中ALT、AST的濃度會顯著升高,因此血清中ALT、AST的含量變化是肝組織受損程度的重要指標[24]。AA染毒后,肝組織出現(xiàn)嚴重病變,肝小葉排列紊亂,肝細胞之間邊緣變得模糊,細胞膜受損,肝細胞腫脹、破裂、自溶,嚴重的甚至出現(xiàn)成片壞死現(xiàn)象[25]。LBP干預后,肝組織損傷得到緩解,其中以LBPH+AA組最接近CT組。表明高濃度LBP對緩解肝損傷具有積極作用。

綜上,LBP對大鼠肝損傷具有一定的保護作用,通過調(diào)節(jié)細胞膜通透性,降低組織細胞中氧化水平,清除機體自由基,從而增強機體對高溫加工食物中AA損傷的耐受性。