李慧婧，魏玉梅，吳慧昊

(西北民族大學實驗教學部，甘肅 蘭州 730000)

蔗糖合酶(sucrose synthase，SuSy)是與蔗糖代謝密切相關的一類關鍵酶，通常以四聚體形式廣泛存在于高等植物中[1]，催化可逆反應蔗糖+UDP果糖+UDPG，即在UDP存在時，將蔗糖分解成UDP-葡萄糖和果糖[2]，通常認為該酶偏向蔗糖的裂解反應[3].由于UDPG可以作為合成糖苷等糖基化合物的供體，因此該酶是一種糖基轉移酶[4].在細胞中，SuSy因存在形式不同而功能不同，如在細胞質中以可溶性形式存在時，主要為淀粉的合成提供產物[5]，而結合在質膜上時，為纖維素的合成提供前提物質UDPG[6].此外，該酶在提升植物固氮能力[7]和提高植株抗逆性方面也有著重要意義[8].

已有研究表明，玉米中缺失SuSy基因會導致種子淀粉含量明顯減少[9]，而當其大量表達時，淀粉和葡萄糖含量又顯著升高[10]，當玉米sh1基因發(fā)生突變時，種子胚乳中的SuSy活性明顯降低，淀粉含量也會下降[11]；西瓜‘04-12’(自交系)在幼果期時，蔗糖的快速積累與SuSy的活性上升關系緊密[12].與其他作物相比，苦蕎淀粉具有低消化性、可溶性糖含量明顯較低[13-14]，因而被作為糖尿病人首選食療作物.可以推測，SuSy在苦蕎種子淀粉合成、糖代謝調控過程中也發(fā)揮著重要作用.燕雪芬等[15]已從苦蕎中克隆了SuSy基因，并分析了基因序列.為了進一步探討SuSy在苦蕎中的生物學功能，首先要獲得純化的蛋白，但目前通過原核表達系統表達SuSy重組蛋白方面的報道較少.因此，本研究擬構建苦蕎重組表達載體pET28a-SuSy，誘導其在大腸桿菌BL21中表達，親和層析純化重組蛋白，為進一步研究該酶的結構和功能及多克隆抗體制備奠定基礎[16].

1 材料與方法

1.1 試驗材料

苦蕎cDNA文庫中克隆得到的重組質粒、E.coliTop10由西北農林科技大學生科院酶學實驗室保存并饋贈.原核表達載體pET28a、E.coliBL21、DNA Marker、PCR產物回收試劑盒、質粒DNA小量抽提試劑盒購自TaKaRa公司.EcoRⅠ、SalⅠ購自Fenmental公司；PfuTurbo DNA聚合酶購自Stratagene公司；T4DNA ligase購自上海生工公司.鈷離子螯合層析介質Talon resin 購自Clontech公司.His-tag鑒定相關試劑購自Pierce公司.

1.2 引物設計與目的基因的擴增

以苦蕎cDNA文庫中克隆得到的重組質粒為模板，選擇完整ORF(1 473 bp)中去除編碼信號肽后的序列設計引物，上游引物P1：5′-CGGCCGGAATTCACCACCTGCGGTCAGCGTC-3′(下劃線處為EcoRⅠ酶切位點)，下游引物P2：5′-GCACGCGTCGACTTATCACTCCTCAATAGC

CAATGGAACA-3′(下劃線處為SalⅠ酶切位點).PCR擴增反應體系為25 μL，包括模板1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，上游引物P1(20 mmol/L)和下游引物P2(20 mmol/L)各0.5 μL，dNTP(10 mmol/L)0.5 μL，MgSO4(35 mmol/L)1.5 μL，pfuTurboDNA聚合酶0.5 μL，超純水補加至25 μL.PCR擴增程序為：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min.瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產物回收試劑盒回收產物.

1.3 原核表達載體的構建

用EcoRⅠ和SalⅠ分別對PCR產物和載體pET28a進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收后，用T4DNA ligase 于16 ℃連接過夜，將連接產物轉入Top10感受態(tài)細胞，涂布在有卡那霉素(終濃度為100 μg/mL)的LB平板上.經菌落PCR驗證為陽性的克隆，提取其質粒進行雙酶切和測序鑒定，將其命名為pET28a-SuSy.

1.4 不同條件下重組蛋白SuSy的表達及表達形式分析

將陽性克隆質粒pET28a-SuSy轉入BL21感受態(tài)細胞，涂布在LB平板上過夜培養(yǎng)，挑取單菌落接種于5 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中(終濃度為50 μg/mL)，37 ℃培養(yǎng)，待OD600為0.8時取出備用.將備用菌液按1∶100接種于LB液體培養(yǎng)基中.

1.4.1 不同誘導溫度和不同IPTG濃度下的表達 分別置于25、28、37 ℃培養(yǎng)，檢測OD600為0.8時，分別向菌液中加入終濃度為1.0 mmol/L IPTG，誘導6 h.37 ℃培養(yǎng)時分別加入終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L的IPTG，誘導6 h 后， SDS-PAGE檢測，分離膠濃度為12.5 %.

1.4.2 不同誘導時間下的表達 25 ℃培養(yǎng)，檢測OD600為0.8時，加入終濃度為1.2 mmol/L IPTG，誘導2、4、6、8、10 h后，SDS-PAGE檢測.

1.4.3 表達形式的分析 將備用菌液按1∶100接種于20 ml LB液體培養(yǎng)基中，加入終濃度為1 mmol/L的 IPTG，誘導6 h，10 000 r/min離心10 min收集菌體，加入1/10體積的超聲裂解液(pH 8.0，50 mmol/L Tris-HCl，50 mmmol/L NaCl)20 ℃過夜，超聲波破碎10 min，功率30 w，間隔時間10 s，破碎后將菌液12 000 r/min離心15 min，取上清和沉淀進行SDS-PAGE檢測.

1.5 目的蛋白的純化及His-tag鑒定

1.5.1 親和層析純化 向上述沉淀中加入適量洗滌緩沖液I[17](1.5 mol/L NaCl，2 % TritonX-100，20 mM EDTA)充分懸浮后再次離心，向沉淀中加入適量緩沖液II(1×PBS，4 mol/L尿素)、滌緩沖液III(pH 8.0，50 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，1 % TrionX-100，2 mol/L尿素)洗滌重懸，共洗滌5次，最后收集沉淀.4 ℃，8 mol/L尿素[17]將其充分溶解，緩慢上樣于鈷離子親和層析柱，平衡緩沖液(1×PBS，8 mol/L尿素)洗脫雜蛋白，150 mmol/L咪唑洗脫目的蛋白，4 ℃過夜透析，透析液pH 8.0，20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl.

1.5.2 His-tag鑒定 取透析后樣品進行SDS-PAGE，取出凝膠，脫色液固定1 h后用超純水洗滌兩次，棄超純水.50 mL特殊染色液染色6 min后用超純水洗滌，每次10 min.棄超純水，向凝膠中加入50 mL組氨酸標簽顯色試劑，溫和振蕩15 min，再用超純水洗滌凝膠2次，紫外凝膠成像系統拍照.

1.5.3 重組蛋白的復性 用8 mol/L尿素溶解洗滌后的包涵體，分別用3種方法嘗試復性[18].方法1：溶液Ⅰ(pH 9.0，20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，6 mol/L尿素)透析，每12 h分別更換1次尿素濃度為4、2 mol/L的溶液；方法2：用溶液Ⅱ(pH 8.0，20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，4 mol/L尿素，1 mmol/L EDTA，20 mmol/L β-巰基乙醇)透析，24 h后尿素濃度換為2 mol/L；方法3：用溶液Ⅲ(pH 8.0，20 mmol/L Tris-HCl，1 % TritonX-100，10 %甘油)復性，10 h后更換為pH 8.0，20 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L甘氨酸，10 mmol/L EDTA的溶液.分別取1 mL透析后樣品，12 000 r/min，4 ℃離心20 min，取上清，丙酮沉淀3 h后，用80 %丙酮洗滌5次后加入適量上樣buffer，進行SDS-PAGE分析.

2 結果與分析

2.1 苦蕎SuSy基因的擴增

電泳結果如圖1所示，在1 000～2 000 bp之間有1條特異DNA條帶(圖1)，大小與預期結果一致.

M：DL2000 DNA maker；1：SuSy基因的PCR產物.M：DL2000 DNA maker；1：PCR products of SuSy gene.圖1 苦蕎SuSy基因的PCR擴增Figure 1 Amplification of SuSy genes

M:DL2000 DNA maker;1:重組質粒EcoRⅠ和SalⅠ的雙酶切鑒定；2：重組質粒的PCR產物.M:DL2000 DNA maker;1:Digestion of pET28a-SuSy by EcoRⅠ和SalⅠ；2：PCR products of pET-28a-SuSy.圖2 重組質粒pET-28a-SuSy的PCR和雙酶切鑒定Figure 2 Identification and restriction enzyme degestion of recombinant vector pET-28a-SuSy

2.2 原核表達載體的構建

重組質粒pET28a-SuSy進行PCR擴增和雙酶切的結果如圖2所示，大小與預期相符，且測序結果證實成功構建了重組表達載體.

2.3 苦蕎SuSy的表達及表達形式的分析

如圖3A所示，經IPTG誘導后，只有含重組質粒的菌液在約53.4 ku處表達了目的蛋白，結果與預期大小相符；未表達目的蛋白的有：只轉入pET28a的菌液、轉入pET28a-SuSy但未經誘導的菌液、未轉入質粒的菌液.目的蛋白SuSy誘導表達成功.如圖3B所示，經超聲裂解后的重組表達菌液，上清(2號泳道)中無蛋白表達，而在沉淀中(3號泳道)53.4 ku處有明顯的條帶，這說明苦蕎蔗糖合酶在E.coli.BL21中以包涵體形式存在.

2.3.1 不同誘導溫度和不同IPTG 濃度對SuSy表達量的影響 如圖4A所示，當IPTG濃度相同時，目的蛋白在25、28 ℃的表達量前者高于后者，但在37 ℃時表達量較25 ℃明顯升高，由此可見，37 ℃的表達量最高.如圖4B所示，溫度相同時，目的蛋白表達量在0.2 mmol/L時最低，0.4、0.6、0.8 mmol/L時變化不明顯，1.0 mmol/L時略微升高，隨著IPTG濃度的繼續(xù)增大至1.2 mmol/L時表達量最高.

A:SuSy的誘導表達，M：蛋白質marker；1：重組對照；2：重組誘導；3：空質粒對照；4：空質粒誘導；5：未誘導菌；6：誘導空菌.B：SuSy表達形式的分析，M：蛋白質marker；1：未誘導菌裂解液；2：超聲破碎后上清；3：超聲破碎后沉淀；4：全菌體蛋白.A： Expression of SuSy，M：Protein marker；1：Non-induced pET28a-SuSy；2：Induced pET28a-SuSy；3：Non-induced pET28a；4：Induced pET28a；5：Non-induced control；6：Induced bacteria.B：Forms analysis of SuSy，M：Protein marker；1：Lysates of non-induced bacteria；2：Supernatant from induced bacteria；3：Precipitation from induced bacteria；4：Total lysates from induced bacteria.圖3 重組蛋白SuSy的表達及表達形式鑒定Figure 3 Expression and forms analysis of SuSy

A：不同溫度下的表達，M：蛋白marker；1：未誘導菌；2：1～4分別為25、28、37 ℃誘導菌.B：不同IPTG濃度下的表達，M：蛋白marker；1：未誘導菌；2～7：分別經0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L IPTG誘導菌.A：SuSy expression at different time，M：Protein Marker；1：Non-induced bacteria；2：1～4:induced bacteria with 25,28,37 ℃,respectively.B：Susy expression at different IPTG concentration，M：Protein marker；1：Non-induced bacteria；2～7：Induced bacteria with 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mmol/L IPTG，respectively.圖4 SuSy在不同溫度和不同IPTG濃度下的表達Figure 4 SuSy expression at different time and IPTG concentration

2.3.2 不同時間對SuSy表達量的影響 如圖5所示，37 ℃、IPTG終濃度為1.2 mmol/L誘導至2 h 時，目的蛋白的表達量最低，隨著時間的增加，其表達量也在逐漸增加，10 h時表達量最大.

2.4 融合蛋白的純化

2.4.1 包涵體的洗滌和親和層析 如圖6A所示，與洗滌前(泳道1)比較而言，多次洗滌和溶解后的重組蛋白包涵體(泳道2-4)已被除去大量雜蛋白，親和層析柱純化后結果如圖6B所示，純化的單一條帶與預期相符，說明目的蛋白SuSy純化成功.

2.4.2 目的蛋白的His-tag鑒定 將純化的目的蛋白進行SDS-PAGE，考馬斯亮藍R-250染色(圖7-B)與His-tag試劑鑒定(圖7-A)的結果相比較可以看出，試驗純化所得蛋白即帶有His標簽的重組蛋白.由于圖7-B所用蛋白Marker帶His標簽，所以在紫外成像時也顯色.

M：蛋白Marker；1：未誘導菌；2～6：誘導2、4、6、8、10 h的菌液.M：Protein marker；1：Non-induced bacteria；2～6：Induced bacteria at 2,4,6,8,10 h,respectively.圖5 SuSy在不同誘導時間的表達Figure 5 SuSy expression in different induction time

A：包涵體電泳檢測，M：蛋白marker；1：未洗滌包涵體；2～4：洗滌后包涵體.B：親和層析純化后蛋白，M：蛋白marker；1：純化后的蛋白.A：SDS-PAGE of inclusin bodied，M：Protein marker；1：Unwashed inclusion bodies；2～4：Inclusion bodies after washing.B：Purified SuSy proteinby affinity chromatography，M：Protein marker；1：Purified protein.圖6 純化SuSy的SDS-PAGEFigure 6 SDS-PAGE of purified SuSy

2.4.3 復性蛋白檢測 將嘗試復性后的蛋白進行SDS-PAGE分析，結果如圖8所示，透析后目的蛋白都在沉淀里，而上清中無目的蛋白，說明透析后沒有得到復性的蛋白.

3 討論

保守結構域分析表明，苦蕎SuSy含有1個GT1糖基化酶功能結構域和4個ADP結合位點，能夠催化果糖-6-磷酸和尿苷-5′-二磷酸葡萄糖形成蔗糖-6-磷酸[15].而SuSy在苦蕎中發(fā)揮的生理功能還有待進一步證實.本試驗構建了原核表達載體pET28a-SuSy，實現了重組蛋白在大腸桿菌 BL21中的高效表達，在37 ℃、1.2 mmol/L IPTG誘導10 h 時表達量最高，最終以包涵體形式存在.外源基因利用大腸桿菌系統表達蛋白，有時易形成包涵體[19]，原因復雜，可能由于苦蕎SuSy的二級結構[15]的組成，使得變性二硫鍵的正常形成、肽鏈正確折疊恢復到原來的構象比較困難.怎樣才能獲得可溶性表達的蛋白是后續(xù)需要解決的問題.已有研究表明，通過優(yōu)化培養(yǎng)基和降低溫度[20]，或是利用共表達熱激分子伴侶(如GroEL等)的方法，可以促進外源蛋白正確折疊和高水平可溶性表達[21].

在體外大量表達蛋白質時，常通過分子克隆的方法，在目的蛋白的N端加入表達標簽以構建重組融合蛋白，該標簽能夠與親和層析柱可逆性、特異性地結合，從而有效分離含有目的蛋白質的重組蛋白，常見的表達標簽有His-tag.1975年，金屬螯合親和層析第1次被用于純化蛋白[22]，因其分離過程簡單、快速、分辨率高，已在生物分離中廣泛應用.本試驗選用原核表達載體pET28a，具有蛋白表達量高、自身帶有His-tag的優(yōu)點，在SuSy蛋白的N端引入pET28a所帶標簽，其中的組氨酸能夠與金屬離子Co2+發(fā)生相互作用而緊密結合，在洗脫過程中，凝膠介質與目的蛋白牢固結合，從而達到分離純化的目的.純化出的重組蛋白可以不用事先切掉6×His-tag便用做抗原產生抗體[22]，為制備苦蕎蔗糖合酶的多克隆抗體奠定基礎.

A：His-tag 鑒定，M：蛋白Marker；1～2：His-tag鑒定后的目的蛋白.B：考馬斯亮藍R-250染色，M：蛋白Marker；1～2：考馬斯亮藍R-250染色后的目的蛋白.A：His-tag of SuSy，M：Protein marke ；1～2：His-tag staining of purified protein.B：Coomassie brilliant blue R-250 staining，M：Protein marker;1～2：Coomassie brilliant blue R-250 staining of purified protein.圖7 純化后SuSy的His-tag檢測Figure 7 His-tag of purified SuSy

M：蛋白marke；1～3：復性后沉淀;4～6：復性后上清.M：Protein marker ；1～3：Supernatant after renaturation,respectively；4～6：Precipitation after renaturation,respectively.圖8 包涵體復性結果分析Figure 8 The SDS-PAGE analysis of incusion bodies refolding

4 結論

本研究構建了重組表達載體pET28a-SuSy，誘導其在大腸桿菌中成功表達了苦蕎SuSy重組蛋白，并采用Co2+親和柱層析純化和His-tag鑒定得到了高純度的重組SuSy蛋白，為進一步研究該酶的結構與功能及多克隆抗體的制備奠定了基礎.