尹東鵬，趙文

(大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧省水生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

大型溞DaphniamagnaStraus作為水域生態(tài)系統(tǒng)的重要物種，具有廣溫性和廣鹽性，其分布廣泛，習(xí)居于淡水池塘、水渠、湖泊、咸水湖及海岸等低鹽度積水中[1]。由于大型溞具有發(fā)育期短、生殖量大、方便易得、可大規(guī)模培養(yǎng)及對水中污染物非常敏感等優(yōu)點(diǎn)[2]，其生態(tài)毒理學(xué)價值得到了眾多環(huán)境保護(hù)機(jī)構(gòu)和標(biāo)準(zhǔn)制定組織(如EPA、OECD、ISO、BS、NF、DEV等)的重視[3]，現(xiàn)已成為一種公認(rèn)的生態(tài)毒理學(xué)受試生物，在水環(huán)境監(jiān)測和水生生物毒理試驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用。目前，國內(nèi)外學(xué)者以大型溞作為受試生物，分別在抗生素藥物[4]、農(nóng)藥[5]、紫外線輻射[6]、石油及化工污染物[7-8]、持久性有機(jī)污染物[9]、重金屬污染等方面進(jìn)行了毒理學(xué)研究，其中重金屬對大型溞生態(tài)毒理學(xué)研究尤為廣泛。

重金屬作為常見的水環(huán)境污染物，具有水環(huán)境中較難降解、易對水生生物產(chǎn)生富集毒性、嚴(yán)重破壞水域生態(tài)系統(tǒng)等特點(diǎn)[10]，因此，研究重金屬對大型溞的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)具有重要意義。本研究中概述了水環(huán)境中重金屬的積累途徑，以及重金屬對大型溞的單一毒性和聯(lián)合毒性的研究進(jìn)展，旨在應(yīng)用大型溞生態(tài)毒理學(xué)為重金屬污染監(jiān)測和生態(tài)風(fēng)險防控提供參考。

1 水環(huán)境重金屬積累途徑

重金屬一般是指密度大于5 g/cm3或相對原子質(zhì)量大于40且具有相似外層電子分布特征的一類金屬元素，其可通過地質(zhì)風(fēng)化作用、大氣循環(huán)、工業(yè)過程、農(nóng)業(yè)污染、生活污染和地表徑流等方式進(jìn)入水環(huán)境，在水環(huán)境中具有分布廣泛、毒性強(qiáng)、遷移轉(zhuǎn)化強(qiáng)和易于生物積累等污染特征[11]，表1為一些重金屬在水環(huán)境中的積累途徑[12]。

表1 水環(huán)境中重金屬的積累途徑

2 大型溞在重金屬毒性研究中的評價方法

急性和慢性毒性試驗(yàn)可應(yīng)用于制定水環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)和重金屬污染評估。急性毒性試驗(yàn)是指在短時間內(nèi)，大型溞接觸高濃度重金屬時，引起大型溞群體產(chǎn)生一定比例的有害影響試驗(yàn)，多以大型溞的存活率作為指標(biāo)，以半數(shù)有效濃度(EC50)、半數(shù)致死濃度(LC50)作為毒性參數(shù)；慢性毒性試驗(yàn)是指重金屬對大型溞的低濃度、長時間的試驗(yàn)，毒性作用遲緩，短時間內(nèi)不會使其致死，表現(xiàn)為大型溞生長發(fā)育減慢、生殖量減少、個體死亡率增加和種群數(shù)量下降[11,13]。

單一毒性試驗(yàn)可了解重金屬對大型溞毒性變化的特點(diǎn)，并為判斷不同化學(xué)形態(tài)重金屬的毒性強(qiáng)弱、不同溞體對重金屬的耐受性、溞體的重金屬積累途徑、水環(huán)境中重金屬污染程度和制定水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。單一毒性試驗(yàn)是指在急性和慢性毒性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，多種重金屬對大型溞獨(dú)立作用，可分為單一急性毒性試驗(yàn)和單一慢性毒性試驗(yàn)。

聯(lián)合毒性試驗(yàn)可進(jìn)一步掌握重金屬聯(lián)合作用方式，并為揭示水環(huán)境中重金屬聯(lián)合作用的毒性機(jī)理、豐富生態(tài)毒理學(xué)研究內(nèi)容及進(jìn)行重金屬復(fù)合污染評估提供科學(xué)參考[14]。聯(lián)合毒性試驗(yàn)是指在單一毒性試驗(yàn)基礎(chǔ)上，研究兩種或兩種以上重金屬同時或相繼對大型溞發(fā)生作用時產(chǎn)生的毒性[11]，可分為聯(lián)合急性毒性試驗(yàn)和聯(lián)合慢性毒性試驗(yàn)。

3 大型溞在重金屬毒性研究中的應(yīng)用

3.1 重金屬單一毒性試驗(yàn)

3.1.1 急性毒性試驗(yàn) 單一急性毒性試驗(yàn)時間短、操作簡便，因此，在重金屬單一毒性研究中被廣泛應(yīng)用。早期的一些研究主要集中于重金屬對大型溞的急性毒性參數(shù)的測定[15-17]。其他一些研究逐漸開始關(guān)注重金屬對大型溞生長和發(fā)育的影響，早期發(fā)育階段的大型溞對Zn、Cu、Cd和Pb 4種重金屬的耐受性比成體階段更強(qiáng)[18]，并且Anderson[19]通過測定10種重金屬對大型溞的64 h EC50發(fā)現(xiàn)，大型溞在蛻皮時更易受到重金屬影響，因此，毒性試驗(yàn)需要保證足夠長的暴露時間才能得出正確的結(jié)果，這些均為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。重金屬種類較多，目前，毒性研究多集中于Zn、Cu、Cd和Pb 4種重金屬，其中，對Cd的研究尤為深入。王茜等[20]證實(shí)了在溞體內(nèi)累積的Cd可對溞體產(chǎn)生氧化損傷、減弱攝食能力，導(dǎo)致大型溞神經(jīng)系統(tǒng)傳導(dǎo)異常。雖然Cd對大型溞神經(jīng)系統(tǒng)有一定的影響，但大型溞對Cd的抗性并不會隨子代遺傳，Bodar等[21]的研究證實(shí)了這一點(diǎn)，大型溞F1中獲得了對Cd的抗性，但將F1幼溞置于無Cd的測試液中，則獲得的對Cd的抗性在21 d內(nèi)丟失。此外，Cd在試驗(yàn)水與原水間的毒性參數(shù)差異顯著，理論上大型溞試驗(yàn)水中48 h LC50的濃度要明顯大于原水，即在原水中，較小濃度Cd就能使大型溞達(dá)到半數(shù)致死，理論值與實(shí)際值存在延遲效應(yīng)[22]。其原因可能是實(shí)驗(yàn)室環(huán)境與實(shí)際環(huán)境營養(yǎng)水平不同，不同營養(yǎng)水平大型溞后代對Cd的敏感性不同，同一齡期最小體型的幼溞對Cd的敏感性是最大體型幼溞的3倍[23]。

大型溞對不同環(huán)境介質(zhì)中不同形態(tài)重金屬的生物可利用性研究已引起學(xué)者們關(guān)注。研究表明，水體上覆水中溶解態(tài)Cd和沉積物中可交換態(tài)Cd是影響大型溞Cd毒性主要形態(tài)[24]；而對其他環(huán)境介質(zhì)的相關(guān)研究中，使用nTiO2(二氧化鈦納米粒子)分別與Ag、As和Cu混合，證實(shí)了nTiO2的存在增加了3種重金屬對幼溞的毒性[25]，采用EDTA或DTPA作為環(huán)境介質(zhì)絡(luò)合了6種重金屬離子，證實(shí)絡(luò)合后毒性的大幅度降低與各金屬螯合物的穩(wěn)定常數(shù)相關(guān)[26]。不同形態(tài)和不同環(huán)境介質(zhì)中重金屬對大型溞毒性不同，而常見形態(tài)的重金屬毒性大小也會顯示出很大差異，Münzinger等[27]通過研究得出，在同一試驗(yàn)條件下不同產(chǎn)地的大型溞對同一重金屬的毒性大小會產(chǎn)生不同的結(jié)果，所以當(dāng)產(chǎn)地、蛻皮時間、生長階段、營養(yǎng)狀態(tài)、延遲效應(yīng)等不同的大型溞對重金屬的毒性大小會產(chǎn)生更大的差異。因此，可以解釋國內(nèi)外學(xué)者以大型溞為受試生物時，測定多種重金屬時產(chǎn)生的不同毒性(表2)，這與國外學(xué)者采用重金屬對模糊網(wǎng)紋溞CeriodaphniadubiaRichard[28-30]和褶皺臂尾輪蟲BrachionusplicatilisMüller[31-33]的研究結(jié)果相似。

表2 重金屬對大型溞的毒性比較

隨著對重金屬化學(xué)和大型溞生理毒性的研究日益增多，國外學(xué)者首先建立起毒性預(yù)測模型，如生物配體模型(BLM)，通過BLM可預(yù)測單一重金屬對大型溞產(chǎn)生的毒性，因此，BLM被廣泛應(yīng)用于單一急性毒性試驗(yàn)，但預(yù)測急性毒性的BLM，僅個別預(yù)測值與觀測值之間吻合度高，如利用BLM研究水中Cu和Cd對大型溞急性毒性預(yù)測時[34-35]，不是所有種類的BLM均可達(dá)到準(zhǔn)確預(yù)測毒性的目的。Heijerick等[36]在傳統(tǒng)BLM基礎(chǔ)上,開發(fā)了大型溞預(yù)測急性鋅的BLM，并采用不同pH、硬度和溶解有機(jī)碳(DOC)含量的17種測試液來驗(yàn)證開發(fā)的BLM，結(jié)果雖然證實(shí)了預(yù)測值和觀測值之間顯著相關(guān)，但88%的預(yù)測值與觀測值之間存在1.3倍誤差，存在著較大誤差的原因可能是BLM以化學(xué)平衡為前提，而許多研究結(jié)果是否建立在平衡狀態(tài)下有待商榷。此外，Al-Reasi等[37]證實(shí)DOC和腐質(zhì)可減輕Cu對大型溞的毒性，這一試驗(yàn)結(jié)果可能驗(yàn)證了重金屬與有機(jī)質(zhì)的結(jié)合也可導(dǎo)致BLM出現(xiàn)誤差這一推測。

雖然單一急性毒性試驗(yàn)可以在短期內(nèi)較好地研究多種重金屬的毒性參數(shù)及毒性大小，但其不能全面系統(tǒng)評價單一重金屬對大型溞的整體毒性，這時則需進(jìn)行單一慢性毒性試驗(yàn)。

3.1.2 慢性毒性試驗(yàn) 單一慢性毒性試驗(yàn)是在長時間低劑量濃度下，研究單一重金屬對大型溞的毒性，以彌補(bǔ)急性毒性試驗(yàn)的不足，并為進(jìn)一步揭示重金屬對大型溞的整體毒性提供數(shù)據(jù)支持。隨著慢性毒性試驗(yàn)研究的深入，一些研究逐漸集中于重金屬的積累途徑、富集作用和毒性預(yù)測。Liu等[39]研究發(fā)現(xiàn)，大型溞從食物來源對Cr累積時比從水相中積累的金屬同化效率(AE)高，但隨大型溞到斑馬魚的食物鏈傳遞過程中，斑馬魚對Cd和Zn的富集程度與大型溞對這2種重金屬積累途徑無關(guān)，不同積累途徑的重金屬會對大型溞產(chǎn)生不同的影響，同種重金屬也會因大型溞產(chǎn)地不同而出現(xiàn)不同的結(jié)果，這些都進(jìn)一步揭示了重金屬與大型溞相互作用的復(fù)雜性。BLM作為毒性預(yù)測的重要手段之一，用來預(yù)測重金屬急性毒性的BLM不適用于預(yù)測慢性毒性，而建立的慢性BLM預(yù)測值與觀測值同樣也存在較大誤差[40-41]，原因可能也是化學(xué)平衡狀態(tài)、重金屬與有機(jī)質(zhì)的結(jié)合等[37]。因此，修正BLM可嘗試從研究重金屬對大型溞毒性作用機(jī)理、重金屬與競爭化學(xué)因子間的化學(xué)平衡狀態(tài)(如重金屬與DOC的動力學(xué)結(jié)合過程)，以及矯正模型表達(dá)式中的參數(shù)等幾方面進(jìn)行，并將研究結(jié)果納入模型中以減少誤差值，這樣修正后的急性和慢性毒性有兩種BLM，可整體對某一重金屬污染提供科學(xué)的毒性預(yù)測。

綜上可知，單一慢性毒性試驗(yàn)是在單一急性毒性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了長時間低劑量濃度下生長繁殖過程中大型溞對重金屬的積累途徑和毒性預(yù)測。單一急性毒性試驗(yàn)和單一慢性毒性試驗(yàn)結(jié)合，可以揭示出單一重金屬對大型溞造成的整體毒性，并可為制定水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)及進(jìn)一步探討重金屬聯(lián)合毒性提供數(shù)據(jù)支持。

3.2 重金屬聯(lián)合毒性試驗(yàn)

隨著單一毒性試驗(yàn)的廣泛開展，研究者逐漸意識到在實(shí)際水體中往往存在多種重金屬污染物，多種重金屬污染物間又存在著相互作用，此時僅僅依靠重金屬對大型溞的單一毒性試驗(yàn)結(jié)果來對重金屬污染水體進(jìn)行評估顯得尤不合適，因此，國內(nèi)外學(xué)者逐步開展了聯(lián)合毒性試驗(yàn)[42-43]。

3.2.1 急性毒性試驗(yàn) 聯(lián)合急性毒性試驗(yàn)作為聯(lián)合毒性試驗(yàn)中的重要組成部分，在大型溞毒性試驗(yàn)中被逐步應(yīng)用。重金屬混合物可增大大型溞的敏感性及生殖參數(shù)[44]，這為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。大型溞對不同環(huán)境介質(zhì)中重金屬混合物的生物可利用性存在一定差異，如納米水穩(wěn)型富勒烯nC60可增強(qiáng)Zn-Cr混合物對大型溞的聯(lián)合毒性，提高了其在大型溞體內(nèi)的積累和自由基活性[45]。此外，環(huán)境介質(zhì)中水質(zhì)參數(shù)變化對重金屬混合物同樣也會造成影響，如增加pH、硬度和DOC可使Cu-Cr混合物對大型溞的聯(lián)合毒性降低[38]。重金屬聯(lián)合作用方式作為聯(lián)合急性毒性研究的重點(diǎn)，主要有協(xié)同作用和拮抗作用兩種方式，董曉曉等[46]的研究證實(shí)了這一點(diǎn)，且隨著暴露時間的延長存在著拮抗作用轉(zhuǎn)換為協(xié)同作用這一作用類型，這與重金屬混合物對西藏擬溞Daphniopsistibetana的生態(tài)毒理學(xué)研究結(jié)果相似[47]，其原因可能是溞體具備一定毒性耐受并且與混合物中的某一重金屬的結(jié)合位點(diǎn)有限，但隨著暴露時間的延長，溞體毒性耐受能力減弱，結(jié)合位點(diǎn)增加，進(jìn)而使重金屬間呈現(xiàn)協(xié)同作用。

聯(lián)合急性毒性試驗(yàn)研究了不同環(huán)境介質(zhì)的重金屬聯(lián)合作用方式對大型溞毒性效應(yīng)的影響，其與單一急性毒性試驗(yàn)相比，增加了大型溞生態(tài)毒理學(xué)研究的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，但僅僅依靠聯(lián)合急性毒性試驗(yàn)也不能更好地揭示出長時間作用下多種重金屬的相互作用機(jī)理，此時就需要進(jìn)行聯(lián)合慢性毒性試驗(yàn)。

3.2.2 慢性毒性試驗(yàn) 聯(lián)合慢性毒性試驗(yàn)是采用長時間作用研究多種重金屬的聯(lián)合作用方式，旨在進(jìn)一步揭示多種重金屬相互作用機(jī)理，在重金屬復(fù)合污染評估中極其重要，應(yīng)用前景廣闊。為探明重金屬聯(lián)合作用時產(chǎn)生拮抗作用的原因，Münzinger等[3]通過研究證實(shí)了Cr耐受溞體均比正常溞體顯示出更強(qiáng)的耐受性，這為進(jìn)一步探究拮抗作用機(jī)理提供了科學(xué)參考。由于相關(guān)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)均是基于單一重金屬所制定，這勢必會忽略重金屬聯(lián)合毒性的影響，因此，國內(nèi)外學(xué)者開展了評價水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的研究。如Biesinger等[42]通過研究證實(shí)，當(dāng)重金屬按照各自安全濃度兩兩配比時，重金屬混合物均會對大型溞的生殖造成顯著影響，這表明重金屬處于混合狀態(tài)時安全濃度并不適用，這為進(jìn)一步評價水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)提供了數(shù)據(jù)支持。Enserink等[43]最早以大型溞作為受試生物，成功證實(shí)了當(dāng)重金屬混合物的每種重金屬濃度與荷蘭水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中制定的標(biāo)準(zhǔn)濃度相同時，可對大型溞造成嚴(yán)重毒性，即當(dāng)水環(huán)境中重金屬以混合物存在時，荷蘭水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)不能起到較好的水質(zhì)評估作用；而國內(nèi)學(xué)者同樣也進(jìn)行了中國水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的評價，Meng等[10]研究顯示，在毒性最小的5種重金屬混合物的LC50中，絕大多數(shù)試驗(yàn)組LC50濃度小于對照組(按照中國漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)GB 1160-89設(shè)計的濃度)，其中Cr對大型溞的單一毒性最低，但其存在使得Hg-Cd-Cu-Pb混合物的毒性增加了6倍以上，這些研究均表明，重金屬處于混合狀態(tài)時，水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)不能較好地發(fā)揮作用。

在聯(lián)合慢性毒性試驗(yàn)中，大型溞對某一重金屬的耐受性會提高對其他重金屬的耐受性，這使得在研究聯(lián)合毒性時更加復(fù)雜，并且多種重金屬聯(lián)合作用時，其毒性參數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單一毒性試驗(yàn)。因此，與單一毒性試驗(yàn)相比，聯(lián)合毒性試驗(yàn)極大地豐富了大型溞生態(tài)毒理學(xué)研究的基礎(chǔ)資料，為開展復(fù)合污染評估提供了更多的理論數(shù)據(jù)和科學(xué)參考。

4 存在問題及展望

4.1 存在問題

4.1.1 重金屬對大型溞的毒性作用機(jī)理 目前，重金屬對大型溞生態(tài)毒理學(xué)研究已日趨深入，但無論是單一毒性還是聯(lián)合毒性試驗(yàn)，關(guān)于重金屬與水環(huán)境理化因子的作用機(jī)理，不同積累途徑和環(huán)境介質(zhì)中不同形態(tài)的重金屬對大型溞的作用機(jī)理，重金屬間的作用方式等仍不明確，因此，應(yīng)充分利用生物化學(xué)和分子生物學(xué)等多種技術(shù)手段，對環(huán)境因子如何改變水中重金屬的化學(xué)形態(tài)及影響大型溞生理生化過程進(jìn)行監(jiān)測，對毒理動力學(xué)(吸收、消化、體內(nèi)存儲、隔離和排出等)[12]和生態(tài)毒理基因組學(xué)(轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和表觀基因組學(xué))[48]進(jìn)行研究，用以解決上述問題并進(jìn)一步揭示重金屬對大型溞的致毒途徑和機(jī)理。

4.1.2 重金屬對大型溞的毒性預(yù)測 在重金屬對大型溞的生態(tài)毒理學(xué)研究中，眾多研究者關(guān)注開發(fā)適用于生態(tài)毒理學(xué)的毒性預(yù)測模型，其中，國內(nèi)外學(xué)者廣泛應(yīng)用的主要有BLM。BLM可將重金屬的生物可利用性和影響重金屬毒性的化學(xué)、生理、毒理過程有機(jī)結(jié)合起來，實(shí)質(zhì)上是指在化學(xué)平衡前提下，重金屬在生物配體的累積毒性與環(huán)境水體中競爭化學(xué)因子(Mg2+、Ca2+、H+、DOC等)有機(jī)結(jié)合的毒性預(yù)測模型[12]。目前，BLM在大型溞的生態(tài)毒理學(xué)研究中，無論是單一急性毒性還是慢性毒性預(yù)測，僅有個別重金屬種類的BLM，其他重金屬BLM(如Cd、Pb等)仍需進(jìn)行探索和構(gòu)建。此外，現(xiàn)有的BLM預(yù)測值與觀測值仍存在相對較大的誤差，如何在研究和實(shí)踐中修正模型減少誤差，仍需進(jìn)行大量工作。

4.1.3 重金屬對大型溞的試驗(yàn)設(shè)計和應(yīng)用 在實(shí)際重金屬污染的水環(huán)境中往往存在多種重金屬污染物，此時僅僅依靠單一毒性試驗(yàn)結(jié)果來判定水質(zhì)污染狀況并不合適[10,42-43]，所以應(yīng)在單一毒性試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步加強(qiáng)和完善聯(lián)合毒性試驗(yàn)。此外，在重金屬對大型溞的生態(tài)毒理學(xué)研究中，由于不同生長階段、蛻皮時間、延遲效應(yīng)、營養(yǎng)狀態(tài)、產(chǎn)地[18-19,22-23,27]及野生和馴化種群等影響下的大型溞均會對試驗(yàn)結(jié)果造成誤差，因此，應(yīng)綜合考慮以上影響因素，設(shè)計單一和聯(lián)合毒性試驗(yàn)，并根據(jù)二者結(jié)果制定標(biāo)準(zhǔn)并進(jìn)行重金屬單一和復(fù)合污染評估。

4.2 展望

目前，國內(nèi)外學(xué)者以大型溞為受試生物，在重金屬污染方面開展了一系列生態(tài)毒理學(xué)試驗(yàn)，并取得了顯著成效，今后仍需在以下幾方面開展進(jìn)一步研究。

(1) 拓展重金屬毒性作用機(jī)理研究。重金屬對外在理化因子、大型溞及彼此間聯(lián)合作用方式的毒性作用機(jī)理尚未深入，亟須進(jìn)一步研究。

(2) 研究方法和手段的不斷完善和進(jìn)步。逐步修正和建立BLM。目前的BLM仍存在誤差且數(shù)量較少，減少誤差修正模型，建立其他重金屬的BLM，仍需進(jìn)行大量工作。

(3) 合理制定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。以大型溞作為水環(huán)境污染監(jiān)測的受試生物時，應(yīng)充分考慮實(shí)際水環(huán)境中重金屬的復(fù)合污染情況，在單一和聯(lián)合毒性試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上制定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)并進(jìn)行重金屬污染評估。