呂世杰，陳付英，張子敬，王李輝，張松山，王二耀，徐照學(xué)，施巧婷

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002； 2.河南省畜禽繁育與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002； 3.平頂山市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 平頂山 467000； 4.平頂山市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)中心，河南 平頂山 467000)

牛繁殖性狀是重要的經(jīng)濟(jì)性狀，對(duì)奶牛和肉牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。繁殖性能好的母牛表現(xiàn)為適時(shí)發(fā)情和易受孕，能夠節(jié)約飼養(yǎng)成本，提高生產(chǎn)效率。繁殖性能的優(yōu)劣不僅關(guān)系到牛群的數(shù)量，而且關(guān)系到整個(gè)牛群的經(jīng)濟(jì)效益。

現(xiàn)代奶牛生產(chǎn)中，隨著對(duì)產(chǎn)奶性狀的高強(qiáng)度選擇，奶牛的繁殖性狀呈現(xiàn)衰退趨勢(shì)[1]，因繁殖性能差而被淘汰的奶牛數(shù)量增加[2]。改良奶牛繁殖性能成為育種工作者重要的研究?jī)?nèi)容，也被認(rèn)為是奶牛未來(lái)選育的重要方向[3-4]。繁殖性狀是復(fù)雜的數(shù)量性狀，受到多個(gè)基因的控制，大多數(shù)繁殖性狀遺傳力的估計(jì)值較低(約為5%)[5]。在奶?；蚪M選擇時(shí),增加選擇指數(shù)中繁殖性狀的比例能夠減緩繁殖性能的衰退趨勢(shì)，說(shuō)明繁殖性狀仍可通過(guò)選種選育進(jìn)行提升[4]。因此，研究人員一直在進(jìn)行繁殖性狀的QTL定位，并希望能夠?qū)TL信息加入到基因組選擇的模型中以提高選種的準(zhǔn)確性。目前，依據(jù)動(dòng)物QTL數(shù)據(jù)庫(kù)(Animal QTLdb)[6]，通過(guò)關(guān)聯(lián)分析共發(fā)現(xiàn)17 867個(gè)QTLs與繁殖性狀有關(guān)，但是主效基因仍不明確。

選擇性清除是指在自然選擇或人工選擇過(guò)程中，群體內(nèi)某些優(yōu)勢(shì)等位基因的頻率增加，其周圍與之連鎖的染色體區(qū)域因搭車效應(yīng)而出現(xiàn)多態(tài)性下降的一種現(xiàn)象。利用全基因組分析獲得不同牛品種全基因組水平的選擇性清除及品種間差異的基因組區(qū)域，并借此鑒定牛重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)候選基因已成為可能[7-8]。利用選擇性清除方法，通過(guò)對(duì)比高低繁殖力品種間的基因組差異，可進(jìn)行牛繁殖性狀候選基因鑒定，或?qū)﹃P(guān)聯(lián)分析結(jié)果進(jìn)行有益補(bǔ)充。

郟縣紅牛作為我國(guó)優(yōu)良的地方黃牛品種，具備適應(yīng)性強(qiáng)和繁殖力高等特點(diǎn)[9-10]，可考慮用來(lái)作為奶牛的比較群體進(jìn)行牛繁殖性狀候選基因鑒定。利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序(Specific-locus amplified fragment sequencing,SLAF-seq)技術(shù)對(duì)中國(guó)荷斯坦奶牛和郟縣紅牛進(jìn)行全基因組SNP檢測(cè)與分型，通過(guò)比較2個(gè)品種間差異的基因組區(qū)域，鑒定牛繁殖性狀相關(guān)的候選基因組區(qū)域及候選基因，以期為牛繁殖性狀相關(guān)的主效基因鑒定提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇97頭郟縣紅牛母牛(J)和32頭中國(guó)荷斯坦奶牛母牛(D)為試驗(yàn)對(duì)象。郟縣紅牛來(lái)源于河南省平頂山市郟縣紅牛良種繁育中心，中國(guó)荷斯坦奶牛來(lái)源于河南省鄭州市周邊2個(gè)奶牛場(chǎng)。

1.2 DNA提取

通過(guò)尾靜脈采集每頭供試牛血樣。使用DNeasy Blood & Tissue試劑盒(Qiagen 公司,德國(guó))提取血液總DNA。檢測(cè)DNA質(zhì)量和完整性，樣品純度要求A260/A280介于1.8～2.0。

1.3 SLAF-seq

通過(guò)SLAF-seq對(duì)試驗(yàn)個(gè)體進(jìn)行測(cè)序以獲得全基因組SNP標(biāo)記[11]。以?；蚪M(UMD 3.1)作為參考序列進(jìn)行測(cè)序及分析，篩選保留位于常染色體上最小等位基因頻率(Minor allele frequency)大于0.05和檢出率(Call rates)大于0.8的SNP位點(diǎn)[12]。

1.4 選擇性清除分析

在每條染色體上使用100 kb的滑動(dòng)窗口及10 kb的步長(zhǎng)檢測(cè)選擇性清除區(qū)域。采用R語(yǔ)言(3.4.1)的PopGenome軟件包計(jì)算各滑動(dòng)窗口內(nèi)SNP位點(diǎn)的遺傳分化系數(shù)(Fst)值和核苷酸多態(tài)性(π ratio)值，判斷該滑動(dòng)窗口是否受到選擇。將Fst值和π ratio值(π奶牛/π郟縣紅牛)的99%分位數(shù)對(duì)應(yīng)的值分別作為閾值，篩選2個(gè)品種間差異的基因組區(qū)域，然后對(duì)所得區(qū)域取交集。將重疊的滑動(dòng)窗口合并為1段基因組區(qū)域。

1.5 候選基因篩選

將通過(guò)選擇性清除方法篩選得到的基因組區(qū)域與Animal QTLdb(release 38)中牛QTLs進(jìn)行比對(duì)，與繁殖性狀QTL重合的區(qū)域作為候選基因組區(qū)域。利用R語(yǔ)言進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過(guò)biomaRt軟件包的篩選功能獲得候選基因組區(qū)域內(nèi)的基因(參考基因組為UMD 3.1)。在Animal Omics數(shù)據(jù)庫(kù)中查看候選基因在母牛繁殖相關(guān)組織間的表達(dá)情況(http://animal.nwsuaf.edu.cn)。該數(shù)據(jù)庫(kù)中，與母牛繁殖相關(guān)的組織樣本有卵巢(Ovary)、輸卵管壺腹部(Ampula)和黃體(Corpus luteum)。根據(jù)區(qū)域內(nèi)基因在這3種組織中的表達(dá)情況繪制基因表達(dá)情況圖并進(jìn)行聚類分析(https://software.broadinstitute.org/morpheus)。以FPKM(Fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)值表示基因表達(dá)情況，根據(jù)基因表達(dá)量之間的Spearman相關(guān)系數(shù)進(jìn)行聚類。如果FPKM>1，認(rèn)為基因在該組織中表達(dá)，F(xiàn)PKM>10則為高表達(dá)[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP標(biāo)記開發(fā)與篩選

對(duì)?；蚪M進(jìn)行電子酶切預(yù)測(cè)后確定使用RsaⅠ和HaeⅢ進(jìn)行酶切，酶切片段長(zhǎng)度在414～444 bp的序列定義為SLAF標(biāo)簽。本試驗(yàn)共開發(fā)232 030個(gè)SLAF標(biāo)簽，平均測(cè)序深度為6.1×，經(jīng)篩選后共得到30 233個(gè)SNP。

2.2 利用選擇性清除方法分析2個(gè)牛品種間差異的基因組區(qū)域

Fst值和π ratio值的99%分位數(shù)分別為0.39和1.49。因此，選取Fst值大于0.39且π ratio值大于1.49的基因組區(qū)域?yàn)?個(gè)牛品種間差異的基因組區(qū)域。經(jīng)過(guò)篩選，共得到了42個(gè)基因組區(qū)域和100個(gè)區(qū)域內(nèi)基因。將得到的基因組區(qū)域與Animal QTLdb(release 38)的牛QTL數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比后，發(fā)現(xiàn)與291個(gè)已知QTL重合。在這42個(gè)候選區(qū)域內(nèi)共有11個(gè)基因組區(qū)域與26個(gè)繁殖性狀QTL重合(圖1、表1)。

藍(lán)色點(diǎn)是以Fst值和π ratio值均大于99%分位數(shù)篩選得到的區(qū)域Blue dots mean the regions with Fst and π ratio values which were greater than 99th percentile of genome-wide values圖1 郟縣紅牛和中國(guó)荷斯坦奶牛品種間差異的基因組區(qū)域Fig.1 Diverged genomic regions between Jiaxian Red cattle and Chinese Holstein cattle

2.3 利用基因表達(dá)量篩選候選基因區(qū)域內(nèi)基因

與繁殖性狀QTL重合的11個(gè)基因組區(qū)域共包含20個(gè)基因，其中14個(gè)基因功能已注釋，且在Animal Omics數(shù)據(jù)庫(kù)中有組織表達(dá)數(shù)據(jù)。依據(jù)FPKM>1篩選，共有9個(gè)基因在卵巢、輸卵管壺腹部或黃體中表達(dá)(圖2)。其中，有8個(gè)基因在卵巢中表達(dá)，7個(gè)基因在輸卵管壺腹部中表達(dá)，5個(gè)基因在黃體中表達(dá)。CFDP1、CFDP2和FAM204A基因在各組織中均高表達(dá)(FPKM>10)。CFDP2與FAM204A基因聚為一類，表明二者具有相似的表達(dá)模式。

表1 郟縣紅牛和中國(guó)荷斯坦奶牛品種間與繁殖性狀相關(guān)QTL重合的高差異基因組區(qū)域Tab.1 Highly diverged genomic regions between Jiaxian Red cattle and Chinese Holstein cattle which overlap with QTLs of reproductive traits

標(biāo)示的數(shù)字為FPKM值 The labeled number means the FPKM value圖2 候選基因組區(qū)域內(nèi)基因在母牛繁殖相關(guān)組織中的表達(dá)情況Fig.2 Expression statues of genes within the candidate regions in tissues related to cattle reproduction

3 結(jié)論與討論

本研究利用SLAF-seq技術(shù)對(duì)郟縣紅牛(母牛)和中國(guó)荷斯坦奶牛(母牛)進(jìn)行了全基因組SNP的開發(fā)，利用選擇性清除方法篩選了2個(gè)品種間差異的基因組區(qū)域(Fst>0.39,π ratio>1.49)。共篩選得到42個(gè)基因組區(qū)域和100個(gè)區(qū)域內(nèi)基因，其中11個(gè)基因組區(qū)域與26個(gè)繁殖性狀QTL重合。在這11個(gè)基因組區(qū)域中，共有9個(gè)基因在母牛繁殖相關(guān)組織中表達(dá)。CFDP1、CFDP2和FAM204A基因在繁殖相關(guān)各組織中均高表達(dá)，可考慮優(yōu)先作為牛繁殖性狀相關(guān)候選基因。

CFDP1和CFDP2基因位于牛18號(hào)染色體。前人研究發(fā)現(xiàn)，18號(hào)染色體含有1個(gè)影響牛繁殖性能的關(guān)鍵QTL(44～62 Mb)，與懷孕率、產(chǎn)犢能力等性狀有關(guān)[4,14]。CFDP1基因編碼顱面發(fā)育蛋白1，與脊椎動(dòng)物的顱面發(fā)育和成骨細(xì)胞生成有關(guān)[15-16]，并可能在胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用[17]。在人類醫(yī)學(xué)研究中，顱面發(fā)育異常的研究意義非凡，因?yàn)轱B面發(fā)育異常往往會(huì)造成嬰兒殘疾或者死亡[18]。CFDP1基因在顱面發(fā)育中的重要作用提示其在生物體發(fā)育過(guò)程中扮演重要角色。該基因在動(dòng)物繁殖過(guò)程中同樣發(fā)揮作用，在小鼠胚胎中，通過(guò)原位雜交，發(fā)現(xiàn)該基因在胚胎發(fā)育早期(E8)廣泛表達(dá)，并可能參與腦、心臟、肺臟等多種組織的發(fā)育[19]。在小鼠子宮胚胎著床點(diǎn)，CFDP1基因表達(dá)量相較于非著床點(diǎn)顯著上調(diào)，表明該基因可能對(duì)胚胎子宮內(nèi)著床起到調(diào)控作用[20]。根據(jù)Animal Omics Database中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)CFDP1基因在母牛繁殖相關(guān)組織中高度表達(dá)，并在卵巢中表達(dá)最高，也表明了該基因在動(dòng)物繁殖過(guò)程中可能發(fā)揮的重要作用。根據(jù)選擇性清除分析結(jié)果，CFDP1基因位于2個(gè)品種間高度差異的基因組區(qū)域(18號(hào)染色體:2 720 001～2 840 000 bp)，并處在懷孕率、第1次配種受胎率和產(chǎn)犢指數(shù)等性狀相關(guān)的QTL區(qū)域內(nèi)?？梢?jiàn)，CFDP1基因可能與動(dòng)物繁殖性能相關(guān)，可優(yōu)先考慮為牛繁殖性狀相關(guān)候選基因。CFDP2為反芻動(dòng)物所特有，是CFDP1的重復(fù)基因，比CFDP1基因多插入了1個(gè)轉(zhuǎn)座子Bov B-LINE，二者都屬于祖先基因Bucentaur(BCNT)的重復(fù)基因[21]。CFDP2基因最早在牛大腦組織中發(fā)現(xiàn)[22]，但是其生物學(xué)功能還不明晰。根據(jù)CFDP2基因的表達(dá)情況和位置信息，認(rèn)為CFDP2基因可能也參與牛繁殖調(diào)控，這是對(duì)該基因生物學(xué)功能的有益補(bǔ)充。此外，BCNT2也為BCNT家族的基因，在本試驗(yàn)中的3種繁殖相關(guān)組織中有表達(dá)，提示 BCNT基因家族可能參與牛的繁殖調(diào)控。BCNT家族大約在20 a前在牛中發(fā)現(xiàn)，其在發(fā)育過(guò)程扮演重要角色，并可能影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)[23]。上述基因或BCNT基因家族是否確參與牛繁殖調(diào)控仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。FAM204A基因位于牛26號(hào)染色體，具體生物學(xué)功能尚不清楚，與CFDP2基因表達(dá)模式類似，其可能也參與繁殖調(diào)控。有研究指出，雞FAM204A基因與第1次產(chǎn)蛋年齡相關(guān)[24]，提示該基因具有作為繁殖性狀候選基因的可能性?？傮w而言，根據(jù)本試驗(yàn)研究結(jié)果，CFDP1、CFDP2和FAM204A基因可優(yōu)先考慮為牛繁殖性狀相關(guān)的候選基因，但是由于繁殖性狀的復(fù)雜性和基因功能研究的片面性，不能排除其他候選區(qū)域內(nèi)基因?yàn)橹餍Щ虻目赡苄浴?/p>

中國(guó)荷斯坦奶牛是19世紀(jì)末期由中國(guó)的黃牛與當(dāng)時(shí)引進(jìn)我國(guó)的荷斯坦牛雜交的品種，郟縣紅牛為中國(guó)地方黃牛品種，二者在遺傳背景上差異較大。在進(jìn)行基因組對(duì)比中，遺傳背景的較大差異會(huì)增加結(jié)果的復(fù)雜性和假陽(yáng)性。本試驗(yàn)篩選得到的42個(gè)基因組區(qū)域，不僅與繁殖性狀有關(guān)，還與產(chǎn)奶、生長(zhǎng)、抗病等多種性狀有關(guān)。通過(guò)與繁殖性狀QTL比對(duì)篩選了11個(gè)基因組區(qū)域，這些區(qū)域是否確與繁殖性狀有關(guān)，有待通過(guò)對(duì)候選基因的驗(yàn)證以進(jìn)一步證實(shí)。

綜上，本研究通過(guò)比較郟縣紅牛和中國(guó)荷斯坦奶牛2個(gè)品種間差異的基因組區(qū)域，獲得了11個(gè)與繁殖性狀相關(guān)的基因組區(qū)域，包含9個(gè)在卵巢、輸卵管壺腹部或黃體中表達(dá)的基因。其中，CFDP1、CFDP2和FAM204A基因可優(yōu)先作為牛繁殖性狀相關(guān)候選基因進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證研究。