俞少博 楊 斌 王珊珊 王佳堃

（浙江大學(xué)奶業(yè)科學(xué)研究所，浙江杭州310058）

反芻動物消化道存在數(shù)量巨大、種類繁多的共生 微生物，使消化道成為動物體內(nèi)最復(fù)雜的微生物“庫”。微生物是引起機(jī)體免疫反應(yīng)的重要抗原物質(zhì)來源，因此，消化道是動物體接觸外界環(huán)境中抗原物質(zhì)最廣泛的部位。在長期的共生關(guān)系中，宿主與消化道微生物之間形成了互利共生的關(guān)系。一方面，微生物能輔助動物體消化利用飼料底物、抑制病原菌定植以及維持消化道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)；另一方面，消化道微生物也能夠刺激宿主的免疫系統(tǒng)，使宿主對消化道內(nèi)定植的微生物產(chǎn)生選擇作用。共生微生物如何在動物的消化道功能發(fā)育中起重要的介導(dǎo)作用，通過調(diào)控消化道微生物定植的手段能否促進(jìn)消化道功能發(fā)育是當(dāng)前的研究熱點。為此，本文在重點綜述消化道微生物演替與消化道功能分化關(guān)系的基礎(chǔ)上，闡述了日糧和瘤胃微生物移植對幼齡反芻動物消化道微生物演替和消化道器官發(fā)育的調(diào)節(jié)作用。

1 消化道微生物演替與消化道功能分化的關(guān)聯(lián)

消化道微生物在宿主生理和發(fā)育過程中扮演重要角色。消化道微生物及其代謝產(chǎn)物參與宿主消化道形態(tài)結(jié)構(gòu)及其免疫系統(tǒng)的發(fā)育調(diào)節(jié)。

1.1 消化道微生物促進(jìn)宿主免疫系統(tǒng)發(fā)育

消化道黏液層和消化道黏膜相關(guān)淋巴組織共同組成腸道免疫防線，而消化道微生物通過刺激杯狀細(xì)胞分泌黏蛋白，保證黏液層完整；通過活性樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)消化道黏膜相關(guān)淋巴組織發(fā)育；通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分化維持機(jī)體免疫平衡，實現(xiàn)了消化道微生物對宿主免疫系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)。

1.1.1 消化道微生物刺激杯狀細(xì)胞分泌黏蛋白

消化道黏液層由杯狀細(xì)胞分泌的黏蛋白組成，覆蓋于上皮細(xì)胞表面。一方面，黏液層具有潤滑作用，利于消化道蠕動和食糜消化；另一方面，由黏蛋白分子構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能夠有效阻止細(xì)菌移位（bacterial translocation，BT）。細(xì)菌移位是細(xì)菌侵入消化道上皮黏膜，經(jīng)淋巴管、腸系膜淋巴結(jié)最終進(jìn)入臟器和血液循環(huán)的過程，可能觸發(fā)全身性免疫反應(yīng)和多系統(tǒng)器官功能衰竭[1]。當(dāng)黏液中缺少黏蛋白或含有的黏蛋白發(fā)生糖基化異常時，可能造成消化道屏障功能受損、通透性增加、細(xì)菌在黏液層快速增殖，從而產(chǎn)生細(xì)菌移位影響機(jī)體健康[2-4]。共生的消化道微生物能夠刺激杯狀細(xì)胞分泌足夠的黏蛋白，保證腸道黏液層結(jié)構(gòu)的完整性。研究表明，無菌動物模型中，結(jié)腸杯狀細(xì)胞減少，使腸道黏液層變薄[5]；當(dāng)腸道細(xì)胞暴露于細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）或肽聚糖（peptidogly?can，PGN）后，杯狀細(xì)胞分泌的黏蛋白增加，黏液層厚度恢復(fù)至正常水平[6]。

1.1.2 消化道微生物刺激腸道淋巴組織發(fā)育

反芻動物腸道中，集合淋巴小結(jié)（又稱派伊爾淋巴結(jié)，peyer’s patches，PP）、孤立淋巴濾泡（isolated lymphoid follicles，ILF）和腸系膜淋巴結(jié)（mesenteric lymph nodes，MLN）共同構(gòu)成腸道淋巴組織（gut-asso?ciated lymphoid tissues，GALT）[7]。樹突狀細(xì)胞（den?dritic cells，DC）通過其表面的Toll樣受體（toll-like re?ceptors，TLR）識別細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物后，進(jìn)一步激活MAL-MYD88和TRAM-TRIF 信號通路，使DC細(xì)胞活化。活化的DC 細(xì)胞具有三種主要的功能：①能夠促進(jìn)PP生發(fā)中心的T細(xì)胞增殖，進(jìn)一步促進(jìn)B細(xì)胞分化并分泌IgA；②通過淋巴血管遷移至MLN，誘導(dǎo)MLN中的效應(yīng)T細(xì)胞增殖，促進(jìn)MLN的發(fā)育過程；③DC細(xì)胞也能刺激B細(xì)胞增殖并募集T細(xì)胞，促進(jìn)隱窩小結(jié)發(fā)育成為成熟的ILF[8]。Hamada 等[9]報道發(fā)現(xiàn)無菌小鼠腸道的ILF發(fā)育不完全，而Bouskra等[10]研究表明革蘭氏陰性菌的PGN可誘導(dǎo)無菌小鼠ILF的形成，說明革蘭氏陰性菌可能通過TLR 受體介導(dǎo)細(xì)菌抗原的刺激，促進(jìn)腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)育。此外，不僅是革蘭氏陰性菌的PGN，Toll 樣受體各家族能夠識別的抗原物質(zhì)有所不同，如TLR4 能夠識別革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的LPS；而TLR2 的配體包括脂蛋白、脂多肽、脂壁酸（LTA）、阿拉伯甘聚糖（LAM）及酵母多糖等；TLR3 能夠特異識別病毒復(fù)制過程產(chǎn)生的ds-RNA；TLR9則能夠特異性識別細(xì)菌的CpG-DNA。因此，通過刺激不同的TLR受體，幾乎所有的共生微生物都可能通過產(chǎn)生抗原刺激宿主的腸道免疫反應(yīng)，最終促進(jìn)免疫系統(tǒng)的發(fā)育。

1.1.3 消化道微生物調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分化

T 細(xì)胞通過分化為輔助性T 細(xì)胞（helper T cells，TH）和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory cells，Treg）分別對腸黏膜免疫屏障作用進(jìn)行調(diào)節(jié)。腸道微生物中，分節(jié)絲狀桿菌（segmented filamentous bacteria，SFB）能夠直接刺激并誘導(dǎo)T 細(xì)胞分化為TH17 細(xì)胞[11]。SFB 定植后使腸道組織中血清淀粉樣蛋白（serum amyloid A，SAA）表達(dá)量上調(diào)，刺激CD11c 細(xì)胞和DC 細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和IL-23，從而促進(jìn)TH17細(xì)胞發(fā)育[12]。病原菌菌鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimunum）能誘導(dǎo)T細(xì)胞分化為TH1細(xì)胞，TH1細(xì)胞能夠產(chǎn)生IFN-γ激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)抵御病原菌侵入。脆弱型擬桿菌（Bac?teroidesfragilis）細(xì)胞壁的成分細(xì)菌多糖A（polysaccha?ride A，PSA）能夠刺激Treg細(xì)胞分化并分泌IL-10，抑制TH1和TH17細(xì)胞的免疫反應(yīng)使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對該微生物的耐受。此外，梭狀芽孢桿菌（Clostridium）Ⅳ家族和ⅪⅤα家族能夠刺激結(jié)腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β，進(jìn)一步誘導(dǎo)T細(xì)胞分化為Treg細(xì)胞，同樣使宿主產(chǎn)生免疫耐受[13]。DC 細(xì)胞通過TLR 識別腸道細(xì)菌的過程中，TLR 激活下游的MAL-MYD88 和TRAM-TRIF 信號通路，產(chǎn)生細(xì)胞因子調(diào)節(jié)T 細(xì)胞向不同亞型分化。因此，不同的細(xì)菌可能通過刺激T細(xì)胞分化為不同的細(xì)胞亞型，實現(xiàn)腸道對共生細(xì)菌的免疫耐受與免疫反應(yīng)的平衡調(diào)控。除細(xì)菌的直接調(diào)節(jié)外，腸道細(xì)菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，如短鏈脂肪酸、膽汁酸、維生素、多胺、脂質(zhì)等，在進(jìn)入腸道黏膜循環(huán)后能夠直接刺激宿主免疫相關(guān)基因的表達(dá)（見表1）。

表1 常見的消化道細(xì)菌代謝產(chǎn)物及其免疫調(diào)節(jié)作用

1.2 消化道微生物促進(jìn)宿主消化道結(jié)構(gòu)發(fā)育

消化道微生物定植與消化道結(jié)構(gòu)發(fā)育通常伴隨進(jìn)行，消化道微生物可能通過缺氧相關(guān)的信號通路、激活JAK-STAT 和JNK 途徑或通過吡咯喹啉醌依賴醇脫氫酶（PQQ-ADH）介導(dǎo)胰島素/胰島素樣生長因子信號通路調(diào)節(jié)腸道干細(xì)胞分化，最終促進(jìn)腸道結(jié)構(gòu)發(fā)育。

1.2.1 細(xì)菌介導(dǎo)缺氧誘發(fā)宿主發(fā)育

Coon等[22]研究發(fā)現(xiàn)無菌的蚊子幼蟲，即便供應(yīng)充足的營養(yǎng)，也僅能存活一齡，而相反，在有大腸桿菌等幾種細(xì)菌存在情況下，孑孓就可發(fā)育為成蟲。通過進(jìn)一步的大腸桿菌基因篩選，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌誘發(fā)宿主發(fā)育與細(xì)胞色素BD 氧化酶有關(guān)，該酶的存在可降低消化道中氧的水平，從而促進(jìn)生長和蛻皮激素誘導(dǎo)蛻皮。消化道中細(xì)菌的有氧呼吸是蚊子發(fā)育過程必不可少的誘因。

1.2.2 細(xì)菌激活JAK-STAT 和JNK 途徑調(diào)節(jié)腸道干細(xì)胞分化

JAK-STAT（Janus kinase -signal transducers and activators of transcription）信號通路由三個成分組成，即酪氨酸激酶相關(guān)受體、酪氨酸激酶JAK和轉(zhuǎn)錄因子STAT，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程。c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun NH2termi?nal kinase，JNK）又被稱為應(yīng)激活化蛋白激酶(stressactivated protein kinase, SAPK)，參與細(xì)胞周期、生殖、凋亡和應(yīng)激等多種生理和病理過程。Buchon 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，無菌果蠅有絲分裂的腸道干細(xì)胞數(shù)量和腸道上皮更新速度均低于正常飼養(yǎng)的果蠅，而且發(fā)現(xiàn)消化道里的微生物通過維持JAK-STAT 和JNK 信號途徑的基本活性，使消化道上皮更新處于正常水平。當(dāng)病原微生物入侵時，JAK-STAT 和JNK 信號途徑被過度激活，加速上皮更新。因此，JAK-STAT和JNK信號通路在腸道干細(xì)胞增殖分化的過程中起調(diào)節(jié)作用，微生物通過上述途徑可能影響腸道結(jié)構(gòu)發(fā)育

1.2.3 PQQ-ADH 介導(dǎo)細(xì)菌調(diào)節(jié)胰島素/胰島素樣生長因子信號途徑調(diào)控腸道干細(xì)胞分化

吡咯喹啉醌依賴醇脫氫酶（pyrroloquinolinequi?none-dependent alcohol dehydrogenase，PQQ-ADH）是醋酸菌乙醇氧化呼吸鏈中的主要脫氫酶，它參與乙酸生成。Shin 等[24]通過構(gòu)建果蠅消化道微生物的突變體，測試了消化道微生物對宿主發(fā)育的影響。研究發(fā)現(xiàn)對宿主發(fā)育構(gòu)成影響的微生物突變體都會減少或嚴(yán)重抑制乙酸的生成，推測微生物的乙酸生成能力是影響宿主發(fā)育的主要因素，且PQQ-ADH 呼吸鏈在調(diào)節(jié)胰島素/胰島素樣生長因子信號途徑調(diào)控腸道干細(xì)胞分化中扮演重要角色。

2 日糧調(diào)控消化道微生物定植與消化道器官發(fā)育

日糧是影響瘤胃發(fā)育的重要因素之一。瘤胃的發(fā)育始于固體飼料的進(jìn)食[25]，一方面，固體飼料能夠提供必要的物理刺激；另一方面，固體飼料能夠在瘤胃中長時間停留發(fā)酵，因此能夠促進(jìn)瘤胃微生物的定植和發(fā)酵產(chǎn)物的生成，進(jìn)而促進(jìn)瘤胃發(fā)育。

2.1 精料對消化道微生物與消化道發(fā)育的調(diào)控

精料能夠提高瘤胃內(nèi)Prevotella、Ruminobacter?amylophilus、Succinimonasamylolytica 和Succinivibrio?dextrinosolvens 等淀粉和糖類分解菌的相對豐度，使碳水化合物在瘤胃中迅速發(fā)酵產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acids，VFA）。高精料日糧使瘤胃上皮單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體1、NHE1、NHE3的表達(dá)量顯著上調(diào)，單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體4 的表達(dá)量顯著下調(diào)[26-27]，從而促進(jìn)瘤胃上皮對VFA 的吸收。VFA 能夠促進(jìn)瘤胃上皮細(xì)胞分化和增殖，其中以丁酸的作用效果最優(yōu)，丙酸次之[28-30]。有研究表明，丁酸能夠促進(jìn)胰島素樣生長因子（IGF-1）、表皮生長因子（EGF），以及生長激素（GH）、胰島素（Insulin）和胰高血糖素（Glucagon）等激素的釋放，促進(jìn)瘤胃上皮的發(fā)育[31]。然而，Suárez等[32]研究發(fā)現(xiàn)，只飼喂精料條件下，牛瘤胃中會形成食糜黏附和瘤胃乳頭聚集，降低了瘤胃的吸收面積影響營養(yǎng)物質(zhì)吸收，不利于瘤胃的健康。因此，使用純精料刺激瘤胃發(fā)育可能影響反芻動物的健康，在開食料中添加少量的粗飼料可能能夠緩解精料引起的負(fù)面效果，既促進(jìn)瘤胃發(fā)育同時保證瘤胃健康。

2.2 粗飼料對消化道微生物與消化道發(fā)育的調(diào)控

粗飼料中富含纖維素，飼喂粗飼料能夠增加瘤胃中纖維分解菌的相對豐度[33]。然而，不同的粗飼料來源對瘤胃微生物的影響不同。Saro等[34]對比了飼喂苜蓿和飼喂黑麥干草的綿羊瘤胃中Fibrobacter succino?genes、Ruminococcusflavefaciens 和真菌等纖維分解菌的豐度發(fā)現(xiàn)，苜蓿組中纖維分解菌的相對豐度顯著高于黑麥干草組（P＜0.05）。Zhang 等[35]在泌乳中期奶牛日糧中分別添加玉米秸稈、羊草和苜蓿三種不同的粗飼料，結(jié)果顯示飼喂苜蓿組的奶牛瘤胃中Prevotella和Selenomonas的相對豐度顯著高于玉米秸稈組的奶牛（P＜0.05），而和飼喂苜蓿或羊草的奶牛相比，飼喂玉米秸稈的奶牛瘤胃中Anaerotruncus、Papillibacter、Thermoactimoyces、Bacillus和Streptomyces的相對豐度較高（P＜0.05）。

在飼喂精料的過程中補(bǔ)飼粗料可以提高幼齡反芻動物日增重、胴體重和瘤胃健康水平[36-37]，補(bǔ)飼粗料的效果受粗料類型、纖維長度以及補(bǔ)飼量的影響[38-39]。本課題組以湖羊為研究對象，研究了粗飼料的早期補(bǔ)飼對幼齡反芻動物瘤胃發(fā)育的影響。飼養(yǎng)試驗結(jié)果顯示，羔羊出生后10 d補(bǔ)飼苜蓿能夠提高斷奶前后開食料和粉狀精料的采食量和營養(yǎng)物質(zhì)攝入量，增加幼齡反芻動物的體重、日增重、胴體重，促進(jìn)前胃和臟器的發(fā)育，減少瘤胃壁食糜黏附[40]。

這一過程中補(bǔ)飼苜蓿使瘤胃微生物區(qū)系在斷奶前趨近于斷奶后的微生物區(qū)系，減少斷奶前后細(xì)菌豐度的波動變化，從而促進(jìn)羔羊?qū)嗄毯笕占Z的適應(yīng)性，減少斷奶應(yīng)激[41]。相比于對照組，補(bǔ)飼苜蓿的羔羊在斷奶前的細(xì)胞代謝過程、細(xì)胞定位、生物質(zhì)量調(diào)控等功能較強(qiáng)；并通過瘤胃組織中鈣信號通路、支鏈氨基酸降解和脂肪酸代謝等通路上調(diào)，促進(jìn)瘤胃的早期發(fā)育[42]。

3 微生物移植對消化道微生物與消化道發(fā)育的調(diào)控

“糞 菌 移 植”（Fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT），是指將健康供體的糞便微生物移植到患病受體的胃腸道內(nèi)重塑受體腸道菌群結(jié)構(gòu)來治療特定疾病的方法。瘤胃微生物移植可在一定程度上改善飼料利用效率，加速消化道免疫耐受。

3.1 瘤胃微生物移植改善飼料利用效率

反芻動物瘤胃中存在大量具有纖維降解能力的微生物，能夠幫助宿主有效利用纖維物質(zhì)。近年來，研究者通過微生物移植，促進(jìn)瘤胃微生物的定植過程來提高反芻動物生產(chǎn)效率。新生反芻動物的瘤胃在出生后數(shù)分鐘即有微生物定植，即使未采食固體飼料，一周內(nèi)也可在瘤胃內(nèi)檢測到纖維降解菌。但這時的瘤胃尚不能承擔(dān)纖維的降解功能，而是隨著日齡增長，多樣性更豐富、生態(tài)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定的瘤胃微生物菌群擔(dān)負(fù)起纖維降解的功能。雖然幼齡反芻動物消化道中早期定植的微生物不一定發(fā)揮其應(yīng)有的功能，但是作為瘤胃功能的重要參與者，早期定植的微生物可能在個體適應(yīng)固體飼料的過程中發(fā)揮作用，以減少斷奶應(yīng)激產(chǎn)生的負(fù)面作用。Ishaq 等[43]通過將野生動物消化道內(nèi)分離出的具較強(qiáng)纖維降解能力的微生物飼喂給幼齡反芻動物，改善了幼齡反芻動物的瘤胃發(fā)酵和飼料利用效率。

作為成熟瘤胃功能的載體，成年瘤胃微生物應(yīng)該是一種幼齡反芻動物微生物移植的供體來源。相比于特定的微生物制劑，瘤胃微生物移植在提早引入大量新微生物的同時，可能加速消化道微生物的定植過程，甚至影響后腸的消化功能和機(jī)體的免疫作用。Zhong 等[44]給羔羊移植成年瘤胃微生物，增加了羔羊0～56 日齡的平均日增重，并且提高了飼料效率。Yu 等研究發(fā)現(xiàn)斷奶前移植更有助于瘤胃微生物“成熟”[45]，瘤胃微生物移植可提高瘤胃中丙酸的供應(yīng)[46]。Barbieri 等[47]進(jìn)一步測試了飼料和供體瘤胃微生物對羔羊瘤胃微生物定植的影響，發(fā)現(xiàn)飼料對瘤胃微生物區(qū)系的影響要大于微生物移植，產(chǎn)生更長遠(yuǎn)的影響。

3.2 瘤胃微生物移植加速消化道免疫耐受機(jī)制建立

相比于瘤胃，腸道在幼齡反芻動物消化功能的作用也越來越受到關(guān)注，微生物在后腸中也能進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)生的VFA，尤其是丁酸，可以促進(jìn)腸道上皮發(fā)育，改善腸道的屏障功能[48]。與此同時，移植進(jìn)入的微生物也具有很強(qiáng)免疫原性，其可能通過調(diào)節(jié)腸道免疫過程對宿主產(chǎn)生影響。早期的研究證明，不管是高壓滅菌的瘤胃液、凍干瘤胃液、瘤胃液離心后的上清液等，在移植進(jìn)入幼齡反芻動物消化道內(nèi)后，能顯著降低腹瀉發(fā)生的概率，這從側(cè)面反映了瘤胃液作為一種免疫制劑，可能影響個體的腸道功能[49]。在單胃動物的研究中發(fā)現(xiàn)，采食粗纖維可以加速腸道纖維素利用菌的定植，并增加揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)生，這一過程加速了腸道上皮維生素A轉(zhuǎn)化酶的表達(dá)，且這一特定酶與腸道致耐受性的樹突狀細(xì)胞增殖有關(guān)[50]。在反芻動物生長前期，為了抵消不必要的免疫反應(yīng)產(chǎn)生的能量損耗，反芻動物腸道可能存在對特定瘤胃微生物的耐受機(jī)制，提前移植的成年瘤胃微生物也可能加速腸道免疫耐受機(jī)制的建立，從而改善動物的腸道健康。

4 小結(jié)

消化道微生物在消化道形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)育和腸道免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的過程中發(fā)揮重要作用，受到廣泛關(guān)注。然而，宿主如何識別微生物及其代謝產(chǎn)物，及不同信號途徑介導(dǎo)微生物對消化道發(fā)育調(diào)節(jié)作用的權(quán)重仍未可知。日糧和瘤胃微生物移植如何助推幼齡反芻動物消化道微生物演替與消化道發(fā)育仍需深入研究。