朱 原 李欣澤 郝 賀 張立偉 劉 洋 王風(fēng)申 張永英，3*

（1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲056038；2.河北中貝佳美生物科技有限公司，河北石家莊050000；3.河北省禽病工程技術(shù)研究中心，河北邯鄲056038）

甜葉菊是菊科草本植物，含有多種功能性成分，包括糖苷類、黃酮類、綠原酸類等[1]。綠原酸是羥基肉桂酸家族中的酚類化合物[2-3]，是許多中藥的主要活性成分，具有抗病毒、抗氧化、調(diào)控脂肪細(xì)胞脂質(zhì)代謝、增強(qiáng)機(jī)體免疫、促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)發(fā)育、提高生產(chǎn)性能、保護(hù)動(dòng)物心血管系統(tǒng)等作用[4-7]。

在國(guó)家對(duì)養(yǎng)殖業(yè)提出“無(wú)抗、減抗和替抗”要求的趨勢(shì)下，開(kāi)發(fā)新型“促生長(zhǎng)、無(wú)殘留、安全”的替抗飼料添加劑具有廣闊的發(fā)展前景。綠原酸在動(dòng)物體內(nèi)只有1/3 以原型的形式被吸收，大部分需要通過(guò)腸道菌群降解成咖啡酸、奎寧酸的形式吸收進(jìn)入血液[8-10]，而且綠原酸作為飼料添加劑直接使用存在不溶性和適口性差等特點(diǎn)，制約了其在動(dòng)物飼料中的廣泛應(yīng)用。綠原酸通過(guò)與乳酸菌協(xié)同發(fā)酵，可使飼料中含有更多的活性乳酸菌菌體、蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物、活性小肽、抑菌物質(zhì)、各種消化酶及其代謝產(chǎn)物，降低抗?fàn)I養(yǎng)因子含量，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，維持動(dòng)物健康[11]。動(dòng)物體內(nèi)腸道菌群的多樣性也影響著能量代謝、免疫反應(yīng)等諸多生理功能[12]。劉亮等[13]研究表明，成分復(fù)雜且含綠原酸的杜仲茶粉能夠促進(jìn)乳酸菌的發(fā)酵產(chǎn)酸，而純品綠原酸則對(duì)其有抑制作用；呂武興等[14]研究發(fā)現(xiàn)，含有綠原酸的杜仲提取物能顯著提高三黃雞的平均日增重，顯著降低盲腸中大腸桿菌的數(shù)量；賴星[15]研究發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬日糧中添加綠原酸能顯著提高末重、平均日增重、平均采食量，顯著降低料肉比，促進(jìn)免疫器官的發(fā)育，提高機(jī)體免疫力。Chen 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬日糧中添加綠原酸能增加盲腸中厚壁菌門和擬桿菌門細(xì)菌的相對(duì)豐度，表明綠原酸有助于調(diào)節(jié)腸道健康。以上研究表明，人們對(duì)杜仲綠原酸的抑菌和促生長(zhǎng)作用關(guān)注較多，而在甜葉菊綠原酸發(fā)酵液的研制及其對(duì)雛雞腸道菌群的調(diào)控作用鮮有報(bào)道。

本研究以甜葉菊綠原酸為研究對(duì)象，以杜仲綠原酸為對(duì)照品，實(shí)驗(yàn)室篩選出的雞源布氏乳桿菌為發(fā)酵菌種，選擇不同濃度的綠原酸和布氏乳桿菌共同培養(yǎng)，篩選最佳濃度，探討甜葉菊綠原酸發(fā)酵液對(duì)雛雞腸道菌群和臨床保護(hù)作用的影響。以期為甜葉菊綠原酸發(fā)酵液的后續(xù)開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

布氏乳桿菌（RG-6）來(lái)自河北省禽病工程技術(shù)研究中心；甜葉菊綠原酸（79%）、杜仲綠原酸（78%）由河北某公司提供；MRS固體培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、BBL 培養(yǎng)基、LBS 培養(yǎng)基、碳酸鈣、丙酮（分析純）、吐溫80、冰乙酸（分析純）均購(gòu)自海博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

臺(tái)式高速離心機(jī)（H-1650，江東儀器裝備有限公司）；恒溫?fù)u床（QIQIAN-2102C，上海啟前電子科技有限公司）；酶標(biāo)儀（Multiskan Spectrum，賽默飛世爾科技公司）；pH計(jì)（PB-10，賽多利斯貿(mào)易有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 綠原酸對(duì)布氏乳桿菌體外生長(zhǎng)的影響

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的布氏乳桿菌，調(diào)整菌液濃度為1×106cfu/ml，160 r/min、37 ℃搖床培養(yǎng)，分別于0、2、4、6、8、10、12、14 h測(cè)定活菌數(shù)和OD600[17]。

活菌數(shù)的測(cè)定：用pH值6.5的PBS緩沖液將布氏乳桿菌菌液倍比稀釋，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

OD600的測(cè)定：取無(wú)菌1.5 ml 離心管，加入菌液，8 000 r/min離心5 min，去掉上層培養(yǎng)基，pH值6.5 PBS緩沖液洗滌菌體2 次，1 ml PBS 緩沖液重懸，酶標(biāo)儀測(cè)定OD600。以O(shè)D600值為橫坐標(biāo)，以活菌數(shù)對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.1.2 綠原酸發(fā)酵液生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將1 ml 布氏乳桿菌菌液接種至50 ml MRS 肉湯，搖床培養(yǎng)8 h 至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，調(diào)整菌液濃度為1×106cfu/ml，按表1分別加入不同濃度的綠原酸，并設(shè)置布氏乳桿菌菌液和丙酮溶劑2個(gè)對(duì)照組。160 r/min、37 ℃搖床培養(yǎng)，分別于0、2、4、6、8、10、12、14 h 測(cè)定各組相應(yīng)的OD600。將各時(shí)間節(jié)點(diǎn)測(cè)的OD600值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程，得到相應(yīng)的活菌數(shù)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以活菌數(shù)對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。使用pH 計(jì)測(cè)定菌液在培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12、14 h的pH 值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，pH 值為縱坐標(biāo)，繪制菌液的pH-t曲線。

1.3.2 綠原酸發(fā)酵液對(duì)雛雞的保護(hù)作用

1.3.2.1 大腸桿菌感染劑量確定

參照郭海濤[18]進(jìn)行大腸桿菌感染的方法，將1 日齡海蘭灰雛雞60 只隨機(jī)分為4 組，適應(yīng)性飼養(yǎng)6 d，7 日齡時(shí)，用O78致病性大腸桿菌皮下注射感染。分組及感染情況見(jiàn)表2。感染后，記錄48 h 內(nèi)死亡率，剖檢死亡雛雞，觀察病理變化。

1.3.2.2 臨床保護(hù)試驗(yàn)

將240 只7 日齡海蘭灰雛雞隨機(jī)分為8 組，每組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10 只雞。大腸桿菌感染劑量為半數(shù)致死量，感染方式同1.3.2.1 節(jié)，感染2 h 后，開(kāi)始灌服相應(yīng)制劑，試驗(yàn)期3 d，具體分組見(jiàn)表3。試驗(yàn)結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)雛雞死亡率。收集血清，采用牛津杯法測(cè)定含藥血清對(duì)大腸桿菌的抑菌效果。無(wú)菌取盲腸內(nèi)容物，利用平板計(jì)數(shù)法，檢測(cè)雛雞盲腸腸道菌群，培養(yǎng)條件見(jiàn)表4。

表1 布氏乳桿菌體外培養(yǎng)試驗(yàn)分組

表2 大腸桿菌感染劑量

表3 臨床保護(hù)試驗(yàn)分組

表4 盲腸細(xì)菌培養(yǎng)條件

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016 初步統(tǒng)計(jì)整理，采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，均值比較采用Duncan's 法，測(cè)定結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 綠原酸對(duì)布氏乳桿菌體外生長(zhǎng)的影響

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制（見(jiàn)圖1）

由圖1 可知，活菌數(shù)對(duì)數(shù)值與吸光度呈線性關(guān)系，線性方程為:y=5.524 0x+7.693 4，R2=0.996 7，可信度較高。

2.1.2 不同濃度綠原酸對(duì)布氏乳桿菌生長(zhǎng)的影響（見(jiàn)圖2）

由圖2a 可知，2.0 mg/ml 杜仲綠原酸使布氏乳桿菌生長(zhǎng)曲線達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期最高活菌數(shù)的時(shí)間為12 h；1.0、0.5 mg/ml 杜仲綠原酸使布氏乳桿菌生長(zhǎng)曲線達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期最高活菌數(shù)的時(shí)間為10 h，且活菌數(shù)均高于2.0 mg/ml 杜仲綠原酸組。2.0、1.0、0.5 mg/ml 杜仲綠原酸使布氏乳桿菌生長(zhǎng)曲線達(dá)到平臺(tái)期的活菌數(shù)均高于布氏乳桿菌菌液組。表明這3 個(gè)濃度的杜仲綠原酸均能促進(jìn)布氏乳桿菌的增殖。

由圖2b 可知，1.0、0.5 mg/ml 甜葉菊綠原酸使布氏乳桿菌生長(zhǎng)曲線達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期最高活菌數(shù)的時(shí)間為12 h。4.0 mg/ml 甜葉菊綠原酸中活菌數(shù)明顯低于其他各組，說(shuō)明4.0 mg/ml 甜葉菊綠原酸對(duì)布氏乳桿菌的生長(zhǎng)有明顯抑制作用。1.0、0.5 mg/ml 甜葉菊綠原酸使布氏乳桿菌生長(zhǎng)曲線達(dá)到平臺(tái)期的活菌數(shù)均高于布氏乳桿菌菌液組，表明這2個(gè)濃度的甜葉菊綠原酸皆能在體外促進(jìn)布氏乳桿菌的增殖。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 不同濃度綠原酸對(duì)布氏乳桿菌生長(zhǎng)的影響

經(jīng)比較甜葉菊綠原酸和杜仲綠原酸對(duì)布氏乳桿菌生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)1.0、0.5 mg/ml 甜葉菊綠原酸比1.0、0.5 mg/ml 杜仲綠原酸與布氏乳桿菌共同發(fā)酵的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)了2 h，為布氏乳桿菌在平臺(tái)期的生長(zhǎng)積聚了能量。

2.1.3 不同濃度綠原酸對(duì)布氏乳桿菌菌液pH值的影響（見(jiàn)圖3）

由圖3 可知，綠原酸與布氏乳桿菌共同發(fā)酵，各組初始pH 值差異不明顯。同一時(shí)間段，與布氏乳桿菌菌液組和丙酮溶劑組相比，加入綠原酸的菌液pH值大部分降低。由于發(fā)酵過(guò)程中綠原酸會(huì)促進(jìn)布氏乳桿菌的生長(zhǎng)，活菌數(shù)增多，導(dǎo)致乳酸增多，同時(shí)綠原酸在乳酸菌的發(fā)酵過(guò)程中，會(huì)有一部分轉(zhuǎn)變成溶于水的咖啡酸和奎寧酸[19]，因此除4 mg/ml 甜葉菊綠原酸組pH 值較高，其他各組pH 值均下降較快，且大部分低于布氏乳桿菌菌液組和丙酮溶劑組。

通過(guò)評(píng)價(jià)布氏乳桿菌對(duì)數(shù)期的保持時(shí)間、平臺(tái)期布氏乳桿菌的活菌數(shù)，我們選擇終濃度為1.0、0.5 mg/ml甜葉菊綠原酸與布氏乳桿菌共同作用8 h的發(fā)酵液進(jìn)行下一步臨床試驗(yàn)。

2.2 甜葉菊綠原酸發(fā)酵液對(duì)雛雞的保護(hù)作用

2.2.1 大腸桿菌感染劑量確定（見(jiàn)表5）

根據(jù)改良寇氏法[20]：

式中：Xm——最大劑量的對(duì)數(shù)；

i——相鄰兩組對(duì)數(shù)劑量的差值；

p——各組動(dòng)物死亡率（%）；

Pm——最大死亡率（%）；

Pn——最小死亡率（%）。

由表5 可知，大腸桿菌O78對(duì)雛雞的半數(shù)致死量LD50=1×108cfu/ml，即1×108cfu/ml 為最佳的感染劑量。

圖3 不同濃度綠原酸對(duì)布氏乳桿菌菌液pH值的影響

表5 大腸桿菌感染劑量確定

2.2.2 臨床保護(hù)試驗(yàn)（見(jiàn)圖4）

圖4 臨床保護(hù)試驗(yàn)雛雞死亡率對(duì)比分析

由圖4可知，Ⅰ組為對(duì)照組，雛雞死亡率最低；Ⅱ組雛雞死亡率最高，表明大腸桿菌感染成功；Ⅲ組為溶劑組，與Ⅱ組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）；Ⅴ組與Ⅳ組相比，雛雞死亡率較低；Ⅴ組與Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ組相比較，雛雞死亡率顯著降低（P＜0.05）。說(shuō)明甜葉菊綠原酸和布氏乳桿菌協(xié)同發(fā)酵液對(duì)雛雞保護(hù)作用優(yōu)于單獨(dú)使用甜葉菊綠原酸的效果，其中Ⅴ組的保護(hù)效果最好。

2.2.3 含藥血清抑菌結(jié)果（見(jiàn)圖5）

由圖5可知，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組的含藥血清對(duì)大腸桿菌的抑菌效果均不明顯，Ⅴ組的抑菌圈最明顯，但抑菌圈直徑很小，判定為陰性。

2.2.4 盲腸腸道菌群檢測(cè)（見(jiàn)表6）

由表6 可知，與Ⅰ組相比，Ⅱ組雛雞盲腸中乳酸菌、雙歧桿菌、乳桿菌的數(shù)量均顯著減少，大腸桿菌的數(shù)量顯著增加（P＜0.05），表明大腸桿菌侵入雛雞體內(nèi)造成腸道菌群紊亂；與Ⅰ組相比，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ組雛雞盲腸中乳酸菌的數(shù)量顯著增加（P＜0.05），Ⅴ、Ⅷ組雛雞盲腸中雙歧桿菌的數(shù)量顯著增加（P＜0.05），Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組雛雞盲腸中乳桿菌的數(shù)量顯著增加（P＜0.05），Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ組雛雞盲腸中大腸桿菌的數(shù)量顯著減少（P＜0.05）。其中Ⅴ組雛雞盲腸中乳酸菌、雙歧桿菌、乳桿菌的數(shù)量最多，大腸桿菌的數(shù)量最少。說(shuō)明甜葉菊綠原酸和布氏乳桿菌協(xié)同發(fā)酵液對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于單純綠原酸的調(diào)節(jié)效果，且Ⅴ組對(duì)雛雞盲腸腸道菌群的調(diào)節(jié)效果最好。

綜上所述，濃度為1.0 mg/ml的甜葉菊綠原酸與布氏乳桿菌共同作用8 h的發(fā)酵液臨床應(yīng)用效果最佳。

3 討論

3.1 甜葉菊綠原酸對(duì)布氏乳桿菌的促生長(zhǎng)作用

圖5 含藥血清對(duì)大腸桿菌的抑菌作用

表6 雛雞盲腸菌群檢測(cè)結(jié)果（×109 cfu/g）

布氏乳桿菌具有益生作用，改善腸道菌群等多種功能[21]；綠原酸與布氏乳桿菌相互作用具有補(bǔ)益扶助作用[22]。因此我們推測(cè)甜葉菊綠原酸可以作為布氏乳桿菌的益生元，為了證實(shí)這一假設(shè)，通過(guò)分析生長(zhǎng)曲線，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)甜葉菊綠原酸在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)布氏乳桿菌生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，甜葉菊綠原酸可以在體外促進(jìn)布氏乳酸桿菌的生長(zhǎng)，通過(guò)分析生長(zhǎng)曲線可以發(fā)現(xiàn)，加入甜葉菊綠原酸后，布氏乳桿菌的延滯期有所延長(zhǎng)。細(xì)菌的延滯期是細(xì)菌剛接入到新鮮培養(yǎng)液后，生長(zhǎng)速度接近于0 的一段時(shí)間，被認(rèn)為是代謝系統(tǒng)正在適應(yīng)新環(huán)境[23]。因此當(dāng)在培養(yǎng)基中加入不同濃度的甜葉菊綠原酸時(shí)，造成了新的環(huán)境，需要時(shí)間適應(yīng)，因而延長(zhǎng)了各組的延滯期。其中濃度越高的甜葉菊綠原酸，對(duì)布氏乳桿菌的促進(jìn)作用不如低濃度的效果好，可能是由于高濃度甜葉菊綠原酸對(duì)腸道中乳酸菌的增殖有抑制作用。適宜濃度的甜葉菊綠原酸可以促進(jìn)布氏乳桿菌的增殖，延長(zhǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。此外由于綠原酸不易溶解，試驗(yàn)中選擇了丙酮作為溶劑，對(duì)布氏乳桿菌的生長(zhǎng)和動(dòng)物發(fā)育暫未發(fā)現(xiàn)異常，但丙酮為有毒物質(zhì)存在危害，因此還需要進(jìn)一步試驗(yàn)確定適合的溶劑。

3.2 甜葉菊綠原酸與布氏乳桿菌的協(xié)同作用

甜葉菊綠原酸與布氏乳桿菌共同發(fā)酵具有很多方面的互補(bǔ)作用，①布氏乳桿菌代謝產(chǎn)生的多種酶，可以將不能被畜禽吸收利用的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為藥理活性較高的小分子物質(zhì)，可以使甜葉菊綠原酸有效成分最大限度地釋放，這些酶類，如纖維素酶、脂肪酶等，可以使其毒副作用降低[24]。②甜葉菊綠原酸作為中藥，其中的一些成分還可以作為益生元，促進(jìn)布氏乳桿菌的增殖，抑制有害菌生長(zhǎng)，起到調(diào)節(jié)腸道菌群的作用?？傊鹑~菊綠原酸和布氏乳桿菌的協(xié)同使用會(huì)起增效作用，提高動(dòng)物機(jī)體的免疫力。③綠原酸在動(dòng)物體內(nèi)的吸收與機(jī)體腸道菌群多樣性具有依賴性[9]，二者共同發(fā)酵可以促進(jìn)綠原酸在腸道內(nèi)的吸收。本研究結(jié)果表明，甜葉菊綠原酸可以促進(jìn)布氏乳桿菌的生長(zhǎng)，布氏乳桿菌可以促進(jìn)甜葉菊綠原酸的吸收，二者協(xié)同發(fā)酵可以顯著增強(qiáng)對(duì)雛雞感染大腸桿菌的保護(hù)作用，死亡率明顯降低，但是含藥血清對(duì)大腸桿菌沒(méi)有明顯的抑菌作用，這和尹良軍等[25]的研究結(jié)果不一致，也許和采血時(shí)間、甜葉菊綠原酸的來(lái)源、提取方法以及溶劑不同有關(guān)，這需要進(jìn)一步證實(shí)。但是甜葉菊綠原酸與布氏乳桿菌共同發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)雛雞盲腸腸道菌群具有顯著的調(diào)節(jié)作用，因此，甜葉菊綠原酸發(fā)酵液具有一定的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。綠原酸與其他菌種是否也具有協(xié)同作用且效果優(yōu)于布氏乳桿菌，還需我們進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

①甜葉菊綠原酸與布氏乳桿菌共同發(fā)酵效果優(yōu)于與杜仲綠原酸共同發(fā)酵。

②濃度為1.0 mg/ml的甜葉菊綠原酸與布氏乳桿菌共同作用8 h的發(fā)酵液臨床應(yīng)用效果最佳。可延長(zhǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，增加活菌數(shù)量，促進(jìn)腸道中乳酸菌、乳桿菌、雙歧桿菌生長(zhǎng)，抑制大腸桿菌增殖，有效地對(duì)腸道菌群進(jìn)行調(diào)節(jié)。

③甜葉菊綠原酸發(fā)酵液可降低雛雞大腸桿菌感染的死亡率，但含藥血清沒(méi)有明顯的抑菌效果。表明甜葉菊綠原酸發(fā)酵液可以促進(jìn)雛雞腸道有益菌群的增殖，提高動(dòng)物機(jī)體的免疫力。