陳麗玲 賀 琴 郭曉波 盧亞飛 羅波文 王自蕊 游金明*
(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 江西省動物營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江西省優(yōu)質(zhì)安全畜禽生產(chǎn)產(chǎn)教融合重點(diǎn)創(chuàng)新中心,江西南昌330045;2.江西中醫(yī)藥大學(xué),江西南昌330004)
腸道微生物跟仔豬健康生長密切相關(guān)。大腸,尤其盲腸是豬的主要發(fā)酵器官,其微生物發(fā)酵集中于大腸的前部,盲腸及近端結(jié)腸對碳水化合物的發(fā)酵量占大腸總發(fā)酵量的92%。大腸的發(fā)酵功能與反芻動物的瘤胃有相似的地方,都可以有效消化日糧中的粗纖維。仔豬斷奶時因飼料類型及環(huán)境的變化易導(dǎo)致仔豬腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)的改變,從而影響仔豬消化吸收性能,同時也將影響機(jī)體的免疫力。因此,保持腸道內(nèi)微生物組成的相對穩(wěn)定,尤其是有益菌比例高于有害菌,有利于仔豬健康生長和正常生產(chǎn)。在飼糧中添加中草藥多糖可在一定程度上調(diào)節(jié)畜禽腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)。王琳(2018)研究發(fā)現(xiàn),在育成雞飼糧中添加0.2%~0.6%白術(shù)多糖能顯著降低盲腸中的大腸桿菌含量,并提高盲腸雙歧桿菌和乳酸桿菌含量。白術(shù)多糖也能改善和調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào),提高厭氧培養(yǎng)的腸道細(xì)菌對糖類的消化能力。參苓白術(shù)丸可顯著降低高脂血癥豚鼠疣微菌門的比例,并顯著增加高脂血癥豚鼠瘤胃球菌屬-1 和Ileibacterium 韋榮球菌屬的比例,降低產(chǎn)糞甾醇真桿菌及嗜黏蛋白-艾克曼菌的比例。但白術(shù)多糖和茯苓多糖配合使用是否能夠發(fā)揮協(xié)同作用,目前在畜禽研究中鮮有報(bào)道。因此,本研究采用HiSeq 測序平臺對斷奶仔豬盲腸內(nèi)容物的微生物群落DNA 片段進(jìn)行雙端(Paired-end)測序,旨在探討飼糧中添加白術(shù)茯苓多糖復(fù)方對仔豬盲腸微生物多樣性和微生物結(jié)構(gòu)的影響,進(jìn)而為探討白術(shù)茯苓多糖對斷奶仔豬腸道屏障功能的調(diào)節(jié)作用提供理論依據(jù)。
白術(shù)多糖和茯苓多糖由四川某公司提供,多糖含量均為37.5%,剩余部分為糊精。白術(shù)多糖和茯苓多糖在使用前按照1∶1預(yù)先混合后待用。
選取150 頭體重接近的23 日齡杜×長×大斷奶仔豬,按照完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方法分為6 個處理,每個處理5個重復(fù),每個重復(fù)5頭仔豬。6個處理組分別飼喂添加抗生素飼糧(硫酸粘桿菌素20 mg/kg+桿菌肽鋅40 mg/kg+喹乙醇100 mg/kg)、空白組飼糧(既不添加任何抗生素也不添加白術(shù)茯苓多糖復(fù)方)及分別添加0.02%、0.04%、0.06%、0.08%白術(shù)茯苓多糖的試驗(yàn)組飼糧。試驗(yàn)期27 d。
仔豬飼喂玉米-豆粕型飼糧。飼糧配方參照NRC(2012)和我國豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(2004)配制。
仔豬飼養(yǎng)于裝有高床、漏縫地板、乳頭式飲水器的保育舍。試驗(yàn)開始前對豬舍進(jìn)行徹底清理消毒。試驗(yàn)過程中,每日飼喂4~5次。所有仔豬自由采食和飲水,其他飼養(yǎng)管理措施、免疫處理按豬場常規(guī)管理程序進(jìn)行。
在試驗(yàn)第27 d,從每個重復(fù)中選取1頭接近平均體重且健康狀況良好的仔豬,用4%戊巴比妥鈉麻醉。待麻醉完全后,對仔豬進(jìn)行頸靜脈放血,沿腹部中線剖開腹腔,取盲腸中段腸管,兩端雙線結(jié)扎,用錫箔紙和保鮮膜包裹后,做好標(biāo)記,置于液氮中速凍,再轉(zhuǎn)至-80 ℃保存。
盲腸內(nèi)容物總DNA 提?。翰捎帽本┨旄锟萍加邢薰井a(chǎn)品Tiangen-Magnetic Soil and Stool DNA Kit 試劑盒檢測其DNA 純度、濃度及質(zhì)量,而后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增、產(chǎn)物純化、文庫制備與庫檢、HiSeq上機(jī)檢測。測序工作由北京諾禾致源科技有限公司完成。
盲腸菌群OTU 聚類分析:對樣品優(yōu)化序列進(jìn)行OTU(Operational Taxonomic Units)聚類分析,將所有優(yōu)化序列比對至OTU 代表序列,篩選與OTU代表序列相似性在97%以上的序列,生成OTU 分析結(jié)果。
盲腸微生物多樣性分析:在考慮序列豐度的前提下,計(jì)算不同隨機(jī)抽樣下多樣性指數(shù)(Shannon 指數(shù)、Simpson指數(shù))和豐富度指數(shù)(Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Ob?served-species 指數(shù))。采用GraphPad Prism(V.7.0.1)軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。利用R Stodio(V.3.0.2)軟件基于加權(quán)的UniFrac距離進(jìn)行主成分分析。
盲腸微生物分類學(xué)統(tǒng)計(jì):對OTU 代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析,并在門(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)、屬(genus)5 個水平上統(tǒng)計(jì)每個樣品的腸道菌群落組成。使用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)對各處理組間微生物群落在門和屬水平上進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn),評估物種豐度的顯著差異,分析組間顯著性差異物種。
所有數(shù)據(jù)用Excel 2013 簡單處理后,采用SPSS 17.0軟件中單因素方差分析(One-way Anova)模型進(jìn)行方差分析,各組數(shù)據(jù)以“平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,各處理組間的差異用單因素方差分析(One-way Anova)和Duncan's 法多重比較。以P<0.05 為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。
圖1 仔豬盲腸微生物OTU分布Flower圖
由圖1 可知,抗生素組、空白組、0.02%白術(shù)茯苓多糖組、0.04%白術(shù)茯苓多糖組、0.06%白術(shù)茯苓多糖組和0.08%白術(shù)茯苓多糖組共有OTU 數(shù)為729,各組獨(dú)有的OTU數(shù)分別為27、139、9、19、8和29。
由表1 可知,通過Alpha 多樣性分析,對比不同組的Shannon 指數(shù)發(fā)現(xiàn),0.08%白術(shù)茯苓多糖復(fù)方組顯著高于抗生素組、空白組和0.02%組(P<0.05);Simpson 指數(shù)空白組顯著低于0.04%、0.06%和0.08%白術(shù)茯苓多糖復(fù)方組(P<0.05),且0.08%組Simpson指數(shù)最高。豐富度指數(shù)Chao 指數(shù)、Ace 指數(shù)空白組均顯著高于其他各組(P<0.05)。通過Beta 多樣性分析可知(見圖2),各組重復(fù)性較好,抗生素組和空白組仔豬盲腸微生物多樣性相似度高;0.06%和0.08%白術(shù)茯苓多糖復(fù)方組仔豬盲腸微生物多樣性相似度高;0.06%和0.08%白術(shù)茯苓多糖復(fù)方組與空白組及抗生素組相比,盲腸微生物多樣性相似度相對較低,尤其是與空白組相比,微生物多樣性相似度最低。
表1 白術(shù)茯苓多糖復(fù)方對斷奶仔豬盲腸微生物群落α-多樣性的影響
圖2 基于Unweighted Unifrac距離的UPGMA聚類樹
表2 白術(shù)茯苓多糖復(fù)方對仔豬盲腸微生物組成的影響(門水平,%)
表3 白術(shù)茯苓多糖復(fù)方對仔豬盲腸微生物組成的影響(屬水平,%)
圖3 仔豬盲腸微生物門水平上的物種相對豐度柱形圖
由表2 和圖3 可知,本試驗(yàn)條件下的仔豬盲腸Bacteroidetes(擬桿菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)、Proteobacteria(變形菌門)和Spirochaetes(螺旋體門)相對豐度較高,屬于優(yōu)勢菌門。Cyanobacteria(藍(lán)藻菌門)、Tenericutes(軟壁菌門)、Actinobacteria(放線菌門)相對豐度較低,屬于劣勢菌門。由圖3 可知,與空白組相比,白術(shù)茯苓多糖復(fù)方各組能增加擬桿菌門和厚壁菌門的相對豐度(P>0.05),抗生素組、0.02%、0.04%、0.06%和0.08%白術(shù)茯苓多糖復(fù)方組仔豬盲腸中變形菌門和放線菌門相對豐度顯著降低(P<0.05);與抗生素組和空白組相比,添加0.02%和0.06%白術(shù)茯苓多糖復(fù)方能顯著增加仔豬盲腸中藍(lán)藻菌門的相對豐度(P<0.05),而添加0.04%、0.06%和0.08%白術(shù)茯苓多糖復(fù)方能顯著增加仔豬腸道中螺旋體門的相對豐度(P<0.05);與抗生素組相比,添加0.04%、0.06%和0.08%白術(shù)茯苓多糖復(fù)方能顯著增加仔豬腸道中軟壁菌門的相對豐度(P<0.05)。
由表3 和圖4 可知,以豐度>1%為優(yōu)勢菌群劃分依據(jù),本試驗(yàn)Prevotella-9(普氏菌屬-9)、Campylo?bacter(彎曲菌屬)、Prevotellaceae-NK3B31(普雷沃氏菌屬NK3B31)、Alloprevotella(擬普雷沃菌屬)、Megasphaera(巨型球菌屬)、Prevotella-1(普氏菌屬-1)、Phascolarctobacterium(考拉桿菌屬)、Buchnera(黑草屬)、Leeia(奈瑟菌科Leeia屬)是斷奶仔豬盲腸優(yōu)勢菌屬。與抗生素組相比,添加白術(shù)茯苓多糖復(fù)方各組的仔豬盲腸普氏菌屬-9、巨型球菌屬和黑草屬相對豐度顯著降低(P<0.05);與空白組和抗生素組相比,添加0.04%、0.06%和0.08%白術(shù)茯苓多糖復(fù)方能顯著降低仔豬盲腸彎曲菌屬的相對豐度(P<0.05)。與抗生素組相比,0.02%白術(shù)茯苓多糖復(fù)方組仔豬盲腸的普雷沃氏菌屬NK3B31、普氏菌屬-1 相對豐度顯著增加(P<0.05);0.06%白術(shù)茯苓多糖復(fù)方組的奈瑟菌科Leeia屬相對豐度顯著高于其他各組(P<0.05)。
圖4 仔豬盲腸微生物的物種豐度聚類熱圖
飼料養(yǎng)分進(jìn)入動物胃腸道后,除了相關(guān)的消化液參與消化過程,大量的腸道微生物也參與其中。腸道內(nèi)的乳酸菌屬、梭菌屬和擬桿菌屬會將飼糧中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和糖類分解成小分子,并被小腸吸收,而大分子蛋白質(zhì)、多肽或膳食纖維會在大腸(盲腸、結(jié)腸和直腸)通過微生物作用被分解吸收。仔豬腸道微生物以盲腸最豐富,也最具有代表性。仔豬早期斷奶應(yīng)激會影響腸道正常菌群的建立;而消化酶分泌不足,未被消化吸收的食物殘?jiān)诤竽c被變性菌門中的大腸桿菌等利用,有害微生物數(shù)量上升,造成腸道正常的微生態(tài)結(jié)構(gòu)遭到破壞。白術(shù)或茯苓與其他中藥配合使用能改善腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)。白術(shù)多糖能促進(jìn)益生菌如嬰兒雙歧桿菌和動物雙歧桿菌的生長。曹俊敏等[10]發(fā)現(xiàn)用茯苓、三補(bǔ)、當(dāng)歸和白術(shù)治療菌群失調(diào)小鼠,四種中藥對小鼠正常菌群均有扶植作用,白術(shù)和三補(bǔ)能顯著增加雙歧桿菌的黏附性。但白術(shù)茯苓多糖復(fù)方對動物腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)影響的報(bào)道極少。
試驗(yàn)動物品種不同、日糧組成不同,動物腸道菌群結(jié)構(gòu)也各有差異。本試驗(yàn)采用Illumina HiSeq 平臺對斷奶仔豬盲腸微生物群落DNA 片段進(jìn)行雙端(Paired-end)測序,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與空白組相比,飼糧中添加0.04%和0.08%白術(shù)茯苓多糖復(fù)方的仔豬盲腸菌群多樣性顯著增加,但菌群豐富度顯著降低,斷奶仔豬盲腸微生物相對豐度前七的為Bacteroidetes(擬桿菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)、Proteobacteria(變形菌門)和Spirochaetes(螺旋體門)、Cyanobacteria(藍(lán)藻菌門)、Tenericutes(軟壁菌門)、Actinobacteria(放線菌門),且抗生素組和白術(shù)茯苓多糖組的Bacteroidetes(擬桿菌門)和Firmicutes(厚壁菌門)是優(yōu)勢菌門,空白組優(yōu)勢菌為擬桿菌門和變形菌門。本試驗(yàn)結(jié)果與張本盛[11]、Pajarillo等[12]、Slifierz等[13]及楊利娜等[14]的研究結(jié)果類似,且擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)是優(yōu)勢菌門,與張本盛[11]、賀琴等[15]結(jié)果一致。空白組的優(yōu)勢菌為擬桿菌門和變形菌門。與空白組相比,抗生素組、0.02%、0.04%、0.06%和0.08%白術(shù)茯苓多糖復(fù)方組仔豬盲腸中變形菌門和放線菌門相對豐度顯著降低。變性菌門是細(xì)菌中最大的一個門,包括很多病原菌,如大腸桿菌、沙門氏菌等致病菌。放線菌是屬于有分支狀菌絲體的一類細(xì)菌,革蘭氏染色為陽性,少數(shù)放線菌能引起動物危害。本研究前期動物飼養(yǎng)過程中空白組的腹瀉情況最為嚴(yán)重,這可能與空白組仔豬盲腸中變性菌門相對豐度增加有密切關(guān)系。飼糧中添加白術(shù)茯苓多糖復(fù)方能降低變形菌門的比例,可以減小一些致病菌對仔豬的危害,進(jìn)而控制腹瀉。另外,在豬腸道內(nèi)擬桿菌和厚壁菌均有降解多糖和改進(jìn)機(jī)體能量吸收的作用[16],兩者相對豐度的增加有利于仔豬對飼料養(yǎng)分的消化。本研究結(jié)果顯示,相比于空白組,飼糧中添加白術(shù)茯苓多糖復(fù)方能提高斷奶仔豬腸道擬桿菌門相對豐度,對厚壁菌門相對豐度也有一定的提高。
本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),與抗生素組相比,添加0.04%、0.06%和0.08%白術(shù)茯苓多糖復(fù)方各組的仔豬盲腸普氏菌屬-9、彎曲菌屬、巨型球菌屬和黑草屬相對豐度顯著降低;0.06%白術(shù)茯苓多糖復(fù)方組的奈瑟菌科Leeia屬相對豐度顯著高于其他各組,0.02%白術(shù)茯苓多糖復(fù)方組仔豬盲腸的普雷沃氏菌屬NK3B31、普氏菌屬-1相對豐度顯著增加。在屬水平上,仔豬盲腸的主要菌屬是普氏菌屬,該結(jié)果與劉穎[17]報(bào)道的一致,其主要功能是降解植物細(xì)胞壁中的膳食纖維,產(chǎn)生數(shù)量豐富的短鏈脂肪酸由機(jī)體吸收。表明適宜的白術(shù)茯苓多糖復(fù)方可以在一定程度上改善仔豬的消化功能。
抗生素組和白術(shù)茯苓多糖組的Bacteroidetes(擬桿菌門)和Firmicutes(厚壁菌門)是優(yōu)勢菌門,空白組優(yōu)勢菌為Bacteroidetes(擬桿菌門)和Proteobacteria(變形菌門)。與空白組相比,飼糧中添加白術(shù)茯苓多糖復(fù)方,一方面能顯著降低仔豬盲腸中變形菌門相對豐度,減少仔豬感染致病菌的機(jī)會,另一方面提高了擬桿菌門相對豐度,促進(jìn)了碳水化合物、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。在屬水平上,仔豬腸道主要菌屬是普氏菌屬,0.02%白術(shù)茯苓多糖復(fù)方能顯著提高仔豬盲腸普雷沃氏菌屬NK3B31 和普氏菌屬-1 相對豐度。由此可見,白術(shù)茯苓多糖在一定程度上能改善斷奶仔豬盲腸的菌群結(jié)構(gòu)。