高晶晶，慕 苗，陳錦中，劉麗娜

(榆林學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 榆林 719000)

小米具有很高的營養(yǎng)價值，含有豐富的碳水化合物、脂肪、維生素、蛋白質(zhì)和氨基酸等[1-2]。陜北米脂小米因其營養(yǎng)更為豐富成為中國著名的小米之一[3]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，米脂小米含有更多的蛋白質(zhì)和脂肪，更是含有8種人體必需的氨基酸，營養(yǎng)比例更加適合[4-5]。

多糖是廣泛存在于動植物體內(nèi)的高分子碳水化合物[6-7]，具有調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤生長、延緩衰老、降血糖、抗輻射、抗菌抗病毒、保護(hù)肝臟等作用[8-14]。作者以陜北米脂小米為研究對象，對其中的多糖進(jìn)行提取研究，利用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化法對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，得到了米脂小米多糖的提取工藝路線，然后對多糖進(jìn)行了體外抗氧化性能測定，為小米多糖的后續(xù)應(yīng)用研究提供了一定理論基礎(chǔ)[15]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料、試劑與儀器

陜北米脂小米：購自陜西米脂縣。

濃硫酸：四川西隴科學(xué)有限公司；乙醇、苯酚：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；抗壞血酸(Vc)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：上海金穗生物科技有限公司；水楊酸、鄰苯三酚、FeSO4：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；H2O2、濃HCl：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；以上所用試劑均為分析純。

電子天平：FA1004，上海良平儀器儀表有限公司；紫外可見分光光度計(jì)：UV-1900，日本島津公司；醫(yī)用離心機(jī)：TL80-2，姜堰市天力醫(yī)療器械有限公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101S，北京科偉永興有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多糖含量的測定及葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

多糖的檢測采用苯酚-硫酸法在490 nm處測其吸光度值[16]。配制質(zhì)量濃度分別為0、20、30、40、50、60、70、80 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，各取2 mL，分別加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%苯酚溶液，立即加入5 mL濃硫酸，混合均勻靜置30 min，待冷卻后，在490 nm處測吸光度值[17]。

1.2.2 多糖提取率的計(jì)算

多糖提取率計(jì)算見式(1)。

η=ρ×V×Nm×100%

(1)

式中：η為小米多糖的提取率，%；ρ為檢測液多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V為粗多糖溶解定容后的總體積，L；m為原料小米質(zhì)量，g；N為稀釋倍數(shù)。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

小米預(yù)處理：將小米與w(乙醇)=95%溶液混合于三口燒瓶中，設(shè)置溫度為50 ℃，水浴加熱3 h進(jìn)行脫脂，后晾干備用。

準(zhǔn)確稱取10 g脫脂后的小米置于三口燒瓶中，加入一定量的蒸餾水，在恒溫水浴下攪拌，提取一定時間后，過濾，取上清液，加入3倍體積w(乙醇)=95%溶液進(jìn)行醇沉，4 500 r/min離心30 min，取沉淀。溶解沉淀并定容，用苯酚硫酸法檢測多糖的含量，計(jì)算多糖提取率。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

單因素實(shí)驗(yàn)只能體現(xiàn)出各個因素單獨(dú)對提取率的影響，而響應(yīng)面優(yōu)化法可以得出各個因素間的交互作用對提取率的影響[18]。因此，綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選提取時間、攪拌速率、V(提取液)∶m(小米)(以下簡稱“液料比”)3個對多糖提取率影響較大的因素，根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計(jì)的基本原理[19-21]，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，并對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到該提取過程的數(shù)學(xué)模型。

1.2.5 小米多糖抗氧化性測定

1.2.5.1 對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)清除率的測定

配制濃度為0.2 mmol/L DPPH·無水乙醇溶液，置于棕色瓶中，現(xiàn)配現(xiàn)用。取經(jīng)分離純化后的小米多糖配制成質(zhì)量濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的溶液，取不同質(zhì)量濃度待測液各2 mL，加入DPPH·乙醇溶液2 mL，搖勻，避光靜置30 min，分光光度計(jì)于517 nm下測定其吸光度值。同時還需做空白對照及同條件下Vc的DPPH·清除率的測定[22]。具體計(jì)算見公式(2)。

X=(1-A0-A1A2)×100%

(2)

式中：X為DPPH·清除率，%；A0為小米多糖和DPPH·混合液的吸光度值；A1為小米多糖和空白溶劑(無水乙醇)混合液的吸光度值；A2為DPPH·溶液和空白溶劑混合液的吸光度值。

1.2.5.2 對羥基自由基清除率的測定

取一定量小米多糖凍干粉配制成質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的多糖溶液。取2 mL 1.8 mmol/L FeSO4和2 mL水楊酸各5份置于不同試管中，搖勻后分別加入上述不同質(zhì)量濃度的樣品2 mL，最后各加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3% 的H2O22 mL，37 ℃水浴下反應(yīng)30 min，分光光度計(jì)于510 nm下測定其吸光度值。同時還需做空白對照及同條件下Vc的羥基自由基清除率的測定[23]。具體計(jì)算見公式(3)。

Y=A0-A1A0×100%

(3)

式中：Y為羥基自由基清除率，%；A0為空白對照的吸光度值；A1為多糖溶液的吸光度值。

1.2.5.3 對超氧陰離子清除率的測定

取一定量的小米多糖凍干粉配制成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的溶液各1 mL，各加入濃度為0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖溶液(pH=8.2)3 mL，置于30 ℃恒溫水浴20 min，各加入7 mmol/L鄰苯三酚3 mL，搖勻，反應(yīng)4 min后，加入1 mL濃鹽酸終止反應(yīng)。分光光度計(jì)于320 nm下測其吸光度值。同時還需做空白對照及同條件下Vc的超氧陰離子清除率的測定[24]。具體計(jì)算見公式(4)。

Z=(1-A0-A1A2)×100%

(4)

式中：Z為超氧陰離子清除率，%；A0為多糖溶液的吸光度值；A1為以H2O代替鄰苯三酚的吸光度值；A2為以H2O代替多糖溶液的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

ρ(葡萄糖)/(μg·mL-1)

由圖1可知，A與ρ(葡萄糖)線性關(guān)系良好。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各影響因素對多糖提取率的影響見圖2。

由圖2a可知，多糖提取率隨著提取時間的增加而增大，4 h時提取率最大，之后隨著時間的增加提取率逐漸減小。因?yàn)橛脽崴釙r多糖從小米的內(nèi)部由固相傳遞至液相需要一段較長的時間，在4 h后，多糖的穩(wěn)定性下降，一部分多糖分解，導(dǎo)致多糖提取率反而降低[25]。因此，確定提取時間為4 h。由圖2b可知，多糖提取率隨溫度的升高增加，因?yàn)闇囟鹊纳呖梢约涌旆肿娱g的運(yùn)動使物質(zhì)的黏度減小，傳質(zhì)阻力減小，物質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)增大，所以傳質(zhì)速度逐漸變大，在50 ℃達(dá)到了最大值。之后多糖提取率隨著溫度的升高反而減小，是因?yàn)闇囟鹊睦^續(xù)升高會導(dǎo)致部分多糖分解[26]。因此，確定最佳提取溫度為50 ℃。由圖2c可知，多糖的提取率隨著液料比的增加而增加，在液料比為20∶1 mL/g時多糖的提取率達(dá)到最高，隨著液料比的繼續(xù)增加，多糖的提取率反而降低，說明過多的提取液反而不利于提取，因此，確定最佳液料比為20∶1 mL/g。由圖2d可知，隨著攪拌速率的增加，多糖的提取率呈上升趨勢，說明適當(dāng)?shù)脑黾訑嚢杷俾蕦Χ嗵堑奶崛∮幸欢ǖ募訌?qiáng)作用，在30 r/min后，多糖的提取率變化不大，基本上趨于平穩(wěn)，說明攪拌的加強(qiáng)作用已經(jīng)不明顯。因此，確定攪拌速率為30 r/min。

提取時間/ha 提取時間對提取率的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

以提取率為響應(yīng)值R，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選出提取時間(A)、攪拌速率(B)和液料比(C)這3個對提取率影響較大的因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)因素與水平見表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，多糖提取模型的建立及方差分析見表3。

表1 設(shè)計(jì)因素與水平編碼表

表2 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與多糖提取率

續(xù)表

由表3可知，響應(yīng)面優(yōu)化法所擬合的陜北小米多糖提取模型為顯著(P=0.008 6<0.01)，該模型失擬項(xiàng)P=0.794 4>0.01為不顯著，說明該模型誤差小，用于該提取過程是科學(xué)合理可靠的。由模型的P值可知(P值越小，說明該項(xiàng)對提取率的影響越大)，X2和X22是顯著的影響因素，因此，攪拌速率對提取率起著關(guān)鍵的作用，攪拌速率的輕微變化都會對小米多糖提取率有較大的影響[27]。不顯著的影響因素為X1、X3、X1X2、X1X3、X2X3、X21、X23，根據(jù)P值的比較可知攪拌速率影響程度大于提取時間影響程度大于液料比影響程度。

表3 陜北小米多糖提取模型方差分析

對以上的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與擬合可以得到該提取模型的回歸方程為：

Y=1.05+0.050X1+0.15X2+0.030X3+0.034X1X2+0.032X1X3+0.011X2X3-0.058X21-0.14X22-0.047X23

2.3.2 各因素間交互作用分析

根據(jù)響應(yīng)面軟件可以得到各因素間交互影響的立面圖，見圖3～圖5。立面圖中越陡峭的一方其對提取的影響越大。由圖3可知，攪拌速率對陜北小米多糖提取率的影響大于提取時間的影響；由圖4可知，提取時間的影響略大于液料比的影響；圖5可知，且小米多糖提取率的影響要明顯大于液料比的影響。由此可得，攪拌速率對陜北小米多糖的提取率影響最大，其次是提取時間和液料比，與方差分析得出的結(jié)論一致。

圖3 提取時間和攪拌速率交互作用對多糖提取率的影響

圖4 提取時間和液料比交互作用對多糖提取率的影響

圖5 液料比和攪拌速率交互作用對多糖提取率的影響

2.3.3 最優(yōu)條件預(yù)測及驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面得到的提取模型可以預(yù)測最佳提取時間為4.3 h，攪拌速率為36 r/min，液料比為20∶1 mL/g，該條件下預(yù)測陜北小米多糖提取率為1.051 4%。為了驗(yàn)證響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，進(jìn)行了3組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得出陜北小米多糖的平均提取率為1.046 7%，與預(yù)測值1.051 4%接近，證明上述響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)是準(zhǔn)確可靠的。

2.4 小米多糖體外抗氧化性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 對DPPH·清除率的測定結(jié)果

ρ(小米多糖)及ρ(Vc)對DPPH·的清除作用見圖6。

ρ/(mg·mL-1)

由圖6可知，ρ(Vc)和ρ(小米多糖)增加的同時，DPPH·的清除率也在增加。質(zhì)量濃度相同時，Vc對DPPH·的清除率均要高于小米多糖。小米多糖清除DPPH·的IC50值為0.095 mg/mL。

2.4.2 對羥基自由基清除率的測定結(jié)果

小米多糖及Vc對羥基自由基的清除作用見圖7。

由圖7可知，隨著ρ(Vc)和ρ(小米多糖)的增加，羥基自由基的清除率也在隨之增加。質(zhì)量濃度相同，Vc對羥基自由基的清除率要高于小米多糖。小米多糖清除羥基自由基的IC50值為0.78 mg/mL。

ρ/(mg·mL-1)

2.4.3 對超氧陰離子清除率的測定結(jié)果

ρ(小米多糖)及ρ(Vc)對超氧陰離子的清除作用見圖8。

由圖8可知，隨著ρ(小米多糖)和ρ(Vc)的增加，對超氧陰離子的清除率也在增加。在超氧陰離子清除的實(shí)驗(yàn)中，Vc的清除率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于小米多糖的清除率。小米多糖清除超氧陰離子的IC50值為0.42 mg/mL。

3 結(jié) 論

對陜北米脂小米中多糖進(jìn)行了提取工藝研究，采用單因素法和響應(yīng)面優(yōu)化法相結(jié)合的方法對提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到優(yōu)化的提取工藝路線為提取溫度50 ℃，提取時間4.3 h，攪拌速率36 r/min，液料比20∶1 mL/g，在該條件下陜北小米多糖的平均提取率為1.046 7%。陜北小米多糖的體外抗氧化性實(shí)驗(yàn)表明，小米對DPPH·、羥基自由基、超氧陰離子均具有一定的清除作用，其IC50值分別為0.095，0.78，0.42 mg/mL，說明其具有一定的抗氧化性，且小米多糖的抗氧化性能與其質(zhì)量濃度有著一定的量效關(guān)系，質(zhì)量濃度越高，抗氧化性越強(qiáng)。