李 慧，盧 玉，鐘 鳴，李小燕，張晨悅，陳文波，王乃娟，陳 輝

（1.中糧營養(yǎng)健康研究院，營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室，北京 102209；2.浙江舟富食品有限公司，浙江 舟山 316200）

牛肉含有豐富的蛋白質、維生素以及礦物質，并且脂肪與膽固醇含量比其他肉類要低，味道鮮美、營養(yǎng)價值高[1]。以牛肉為原料的菜肴數(shù)不勝數(shù)，其中土豆燒牛肉味道濃郁，肉菜結合，營養(yǎng)豐富，深受消費者喜愛。因此，實現(xiàn)土豆燒牛肉方便菜肴的工業(yè)化生產(chǎn)，可滿足消費者對這一傳統(tǒng)菜肴方便、快捷、營養(yǎng)、衛(wèi)生的大量需求[2]。但土豆燒牛肉產(chǎn)品含有豐富的淀粉、蛋白質、脂肪、氨基酸、維生素等營養(yǎng)成分[3]，另外生產(chǎn)所用原輔料種類繁多，來源復雜。如果原輔料控制不嚴，殺菌不徹底，在適宜的貯藏條件下，殘留微生物極易大量繁殖，引起產(chǎn)品脹袋及腐敗變質等問題，不僅影響食用的口感，更威脅人體健康，同時帶來經(jīng)濟損失。因此分析土豆燒牛肉方便菜肴產(chǎn)品脹袋微生物，為更好的確認原輔料驗收、殺菌等工藝參數(shù)，并保留產(chǎn)品原有色、香、味等奠定良好的基礎。

有關食品脹袋微生物分離鑒定的報道較多，如謝婷婷等[4]從脹袋鮑汁中分離出地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌；馮勁等[5]從變質番茄沙司和燒烤汁中分離并鑒定了4株乳酸菌；李新楠等[6]從脹袋真空包裝鮮切藕片中分離鑒定出陰溝腸桿菌，蠟樣芽孢桿菌和酵母菌。Xu[7]等從脹罐濃縮牛奶中分離鑒定了6株嗜滲菌膜假絲酵母（Candida pelliculosa）。但是對于引起土豆燒牛肉方便菜肴產(chǎn)品脹袋的特定污染微生物研究報道較少，且不同的食品脹袋微生物應有不同的針對性分離、鑒定和分析。

目前，微生物鑒定常用的方法有形態(tài)觀察、生化鑒定和分子生物學鑒定[8-9]?；|輔助激光解吸電離飛行時間質譜MALDI-TOF MS技術用于微生物鑒定是近幾年發(fā)展起來的一門新技術，通過檢測未知微生物的蛋白質指紋圖譜，并與質譜圖數(shù)據(jù)庫中特征性譜圖進行比對，從而對待測微生物進行快速鑒定。該方法具有檢測成本低、檢測時間短、易于操作等技術優(yōu)勢。嵇金如[10]等利用MALDI-TOF MS技術，有效鑒定了20株生化法無法區(qū)分的醫(yī)院不動桿菌（Acinetobacternosocominalis）和皮特不動桿菌（Acinetobacter pittii）。H?ll等[11]利用MALDI-TOF MS技術鑒定氣調包裝禽肉腐敗微生物的動態(tài)變化，證明該技術不僅鑒定通量高，鑒定準確率也高。

本研究以脹袋土豆燒牛肉方便菜肴試制產(chǎn)品為原料，通過選擇分離得到純化微生物菌種，并將MALDI-TOF MS技術與常用的微生物鑒定方法相結合對所分離純化的微生物進行菌種鑒定，進一步把分離鑒定的微生物回接產(chǎn)品進行產(chǎn)氣性能驗證，旨在確定引起本研究產(chǎn)品脹袋的微生物種類，使得脹袋原因得到有效溯源，為方便菜肴生產(chǎn)企業(yè)采取有效控制措施，保障方便菜肴產(chǎn)品生產(chǎn)的質量與安全，避免生產(chǎn)經(jīng)濟損失提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品正常及脹袋土豆燒牛肉方便菜肴：浙江舟富食品有限公司提供的試制產(chǎn)品。

1.1.2 培養(yǎng)基

孟加拉紅培養(yǎng)基、麥芽浸膏（瓊脂）培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯（瓊脂）培養(yǎng)基、MRS（瓊脂）培養(yǎng)、MC瓊脂培養(yǎng)基：購自北京陸橋技術有限責任公司。

1.1.3 化學試劑

細菌革蘭氏染液、細菌芽孢染液：北京陸橋技術有限責任公司；NaCl分析純：北京化工廠；細菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物純化試劑盒：天根生化科技有限公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）、Taq酶（5U/uL）及Buffer：寶生物工程（大連）有限公司；引物：英濰捷基上海貿(mào)易有限公司合成；質譜樣本預處理試劑盒、標本板：Autobio安圖生物工程股份有限公司。

1.2 主要儀器與設備

拍擊式均質器400 VW：法國Interscience公司；IPP260 低溫培養(yǎng)箱：德國Memmert公司；生物安全柜：新加坡ESCO；Autof MS1000基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀：安圖實驗儀器（鄭州）有限公司；Scope A1正置相差顯微鏡：德國ZEISS；Scan1200 自動菌落計數(shù)儀：法國Interscience公司；SQ510C立式壓力蒸汽滅菌器：日本YAMATO；Bead Beater：美國Biospec公司；Veriti梯度PCR儀：美國Lifetechnologies；NanoDrop 2000超微量分光光度計：美國ThermoFisher公司；XR System凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 脹袋微生物菌種的分離和純化

從脹袋土豆燒牛肉方便菜肴產(chǎn)品中無菌操作稱取25 g樣品，置盛有225 mL生理鹽水的無菌均質袋中，拍擊式均質器拍打1～2 min，制成1∶10的樣品勻液，然后將此樣品進行10倍梯度稀釋至10-6[12]。取各梯度稀釋樣品勻液1 mL于無菌平板中，將15～20 mL冷卻至46 ℃的孟加拉紅培養(yǎng)基、麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、MC瓊脂培養(yǎng)基傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻。

孟加拉紅培養(yǎng)基平板、麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基平板倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d；營養(yǎng)肉湯瓊脂平板、MRS培養(yǎng)基平板、MC培養(yǎng)基平板倒置于36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中分別需氧和厭氧培養(yǎng)（厭氧罐）2～3 d。根據(jù)菌落形態(tài)，大小及顏色的不同，挑選不同的單菌落接種于相應的固體培養(yǎng)基中至少純化3次，最后接種試管斜面于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 形態(tài)學觀察

將保藏菌株001、002、003、004、005和006在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃線，36 ℃培養(yǎng)48 h，將菌株007在MRS瓊脂培養(yǎng)基上劃線，36 ℃厭氧培養(yǎng)72 h，觀察菌落生長情況及菌落形態(tài)，取單個菌落1環(huán)進行革蘭氏染色和芽孢染色，觀察菌體形態(tài)。

1.3.3 分子生物學鑒定

挑取培養(yǎng)平板上的單菌落分別接種營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或MRS液體培養(yǎng)，36 ℃培養(yǎng)24～72 h至OD6001.0以上。取1 mL菌液12 000 r/min離心10 min后，棄去上清，按照細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組的說明書規(guī)定操作，所得的基因組用超微量紫外分光光度計檢測濃度和純度。

16S rRNA序列擴增所用引物，正向引物為27F：5’-AGAGCCTGGCTCAGTTTGAT-3’反向引物為1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’[13-14]。

PCR反應體系：30 μL反應體系，依次加入無酶無菌水19.2 μL、10×Buffer 3 μL、dNTPs 2.5 μL、引物各1.5 μL、Taq酶0.3 μL（5 U/μL）、所提取的基因組2 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性10 min，進入循環(huán)程序，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)，再72 ℃延伸10 min，4 ℃條件下暫時保存，-20 ℃條件下保存?zhèn)溆?。PCR完成后將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

將電泳檢測后的PCR產(chǎn)物送至英濰捷基上海貿(mào)易有限公司進行測序，獲得16S rRNA基因序列。測序結果在美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank中進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）分析比對，并進行同源序列搜索，根據(jù)同源序列搜索結果，導出同源性≥99%菌株的16S rRNA基因序列區(qū)。

1.3.4 MALDI-TOF MS鑒定

微生物菌種鑒定采用Autobio公司推薦的方法，質譜儀線性正性模式，正離子采集分子量為2 000～20 000的蛋白質圖譜。每個樣本在不同位置擊打3次，每次40次激光點擊，采集得到的質譜通過軟件進行校正，然后與儀器內(nèi)的已知微生物數(shù)據(jù)庫圖譜進行比對，軟件對每一組蛋白質的質譜比對和微生物鑒定給出相應的分數(shù)（0～10），最終給出鑒定結果。根據(jù)Autobio標準，分數(shù)越高，鑒定準確定的可信度越高。

1.3.5 脹袋微生物產(chǎn)氣性能驗證

將從脹袋土豆燒牛肉方便菜肴樣品中分離純化和鑒定的菌株001～006接種肉湯培養(yǎng)基36 ℃培養(yǎng)24 h，菌株007接種MRS液體培養(yǎng)基36 ℃厭氧培養(yǎng)36 h。調整菌液濃度OD600為0.6左右備用。無脹袋現(xiàn)象土豆燒牛肉方便菜肴產(chǎn)品121 ℃滅菌30 min，無菌操作取100 g于無菌袋中并接種菌液，接種量為5%。菌株001～007接種樣品無菌袋封口后36 ℃培養(yǎng)觀察產(chǎn)氣脹袋現(xiàn)象，菌株007接種樣品同時置厭氧罐中36 ℃培養(yǎng)觀察產(chǎn)氣脹袋現(xiàn)象，以未接種的樣品為空白對照。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

使用MEGA 6.0軟件對分離微生物的16S rRNA基因序列和GenBank內(nèi)BLAST同源性比對結果構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

質譜分析儀采集軟件為Autof Acquirer，分析軟件為Autof Analyzer，用標準品進行系統(tǒng)誤差校正。微生物屬及種判斷標準：9.5～10.0為種水平置信，可能的亞種；9.0～9.5為種水平置信；6.0～9.0為屬水平置信；0.0～6.0為不可置信。本研究選取≥6.0為待測菌株的鑒定結果。

2 結果與分析

2.1 分離菌株菌落及菌體形態(tài)觀察

通過對脹袋土豆燒牛肉中的微生物進行分離、純化、簡單形態(tài)學觀察后得到7株不同形態(tài)的細菌，未檢出真菌類微生物。7株細菌依次編號為001、002、003、004、005、006和007，菌落形態(tài)和細胞形態(tài)見圖1。

圖1 細菌的菌落及菌體形態(tài)

如圖1所示，菌株001菌落乳白色，表面粗糙不透明（A），菌體桿狀，革蘭氏染色陽性（B），芽孢橢圓形，中生（C）。菌株002菌落乳白色，表面粗糙不透明（A），菌體桿狀，革蘭氏染色陽性（B），芽孢橢圓形，中生（C）。菌株003菌落白色，菌落較小，圓形，光滑，凸起，濕潤，不透明，邊緣整齊（A），菌體球狀，革蘭氏染色陽性（B）。菌株004菌落白色，菌落較小，圓形，光滑，凸起，濕潤，不透明，邊緣整齊（A），菌體球狀，革蘭氏染色陽性（B）。菌株005菌落乳白色，表面粗糙（A），菌體桿狀，革蘭氏染色陽性（B），培養(yǎng)48 h，芽孢較少，芽孢橢圓形，中生（C）。菌株006菌落乳白色，表面粗糙（A），菌體桿狀，革蘭氏染色陽性（B），培養(yǎng)48 h，芽孢較少，芽孢橢圓形，中生（C）。菌株007菌落乳白色，圓形、表面光滑濕潤，邊緣整齊（A），菌體長桿狀，革蘭氏染色陽性（B），芽孢橢圓形（C）。

壽司最傻了，比我傻多了！有一次它在玩跑輪，跑得賊快賊快，過了一會兒，可能是累了，忽然停了下來。它不知道有慣性，一下被甩了出來，前腳和后腳在空中動來動去，叭的一聲摔在地上，成了一塊餅！我在那里笑，沒想到我傻，它比我更傻！我以為它在跑輪里面吃了虧，會怕這個跑輪，不敢再上去了。沒想到，它直接跑到跑輪上面上廁所，上完還在上面跑。傻是不是我們倆的亮點？就在我想這個問題的時候，鷯哥的飯沒了，烏龜被太陽烤著，水被曬得滾燙滾燙的……

2.2 細菌16S rRNA基因序列同源性比對與系統(tǒng)發(fā)育分析

將菌株001～007的16S rRNA基因序列與GenBank內(nèi)已知菌株的相應序列進行比對，通過同源性比對結果構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，見圖2。

如圖2所示，菌株001、002與多株枯草芽孢桿菌/枯草芽孢桿菌亞種（Bacillus subtilis/ Bacillus subtilissubsp.subtilis）的同源性達99%以上，菌株001、002與Bacillus subtilisstrain ASB-199（MK515026.1:73-1271）在同一分枝上，且通過Bootstrap的驗證表明它們具有較高的置信度，支持度達到61%（圖2a），因此可以將分離菌株001、002鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。菌株001和002聚為一枝的支持率為99%，顯示這兩株枯草芽孢桿菌具有很強的親緣關系，為同一來源的菌株。

圖2 以16S rRNA基因序列為分子標記的7株細菌系統(tǒng)發(fā)育樹

菌株003與表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）strain IBK-11（MN428237.1:137-1333）在同一分枝上，Bootstrap驗證表明支持度達到78%（圖2b），因此可以將分離菌株003鑒定為Staphylococcus epidermidis。菌株004與表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）strain PB32（MN689679.1:166-1351）、PB41（MN689682.1:154-1339）、（MH591459.1:104-1289）在同一分枝上，Bootstrap驗證表明支持度達到100%（圖2b），因此可以將004鑒定為Staphylococcus epidermidis）。菌株003、004在不同分枝上，顯示這兩株表皮葡萄球菌為不同來源的菌株。

菌株005與地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）strain B-9（MN756663.1:130-1318）、CRh49（MN726520.1:112-1300）、GT10B（MK100810.1:147-1335）在同一分枝上，Bootstrap驗證它們的支持度達到100%（圖2b），因此可以將分離菌株005鑒定為Bacillus licheniformis。菌株006與Bacillus licheniformisstrain NFS-STR-7（MF079355.1）在同一分支上，Bootstrap驗證它們的支持度達到100%（圖2c），因此可以將分離菌株006鑒定為Bacillus licheniformis。菌株005、006在不同一分枝上，顯示這兩株地衣芽孢桿菌為不同來源的菌株。

菌株007與Bacillus coagulansstrain SF1018（MN588271.1:41-1235）在同一分枝上，Bootstrap驗證它們的支持度達到100%（圖2d），因此可以將分離菌株007鑒定為Bacillus coagulans。

2.3 MALDI-TOF-MS鑒定結果

MALDI-TOF-MS鑒定結果見表1

表1 分離菌種Autof ms1 000鑒定結果

如表1所示，分離菌株001、002鑒定結果為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），003、004鑒定結果為表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis），005、006鑒定結果為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），以上菌種鑒定結果得分＞9.0，為種水平置信。007鑒定結果為凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans），鑒定結果得分為7.425，為屬水平置信。MALDI-TOF-MS鑒定結果進一步驗證了16S rRNA基因序列同源性比對與系統(tǒng)發(fā)育分析結果。結合形態(tài)特征，確定這7株菌中001、002為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、003、004為表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、005、006為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、007為凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）。其中，兩株枯草芽孢桿菌（001、002）為相同來源菌，兩株表皮葡萄球菌（003、004）為不同來源菌、兩株地衣芽孢桿菌（005、006）為不同來源菌。

2.4 脹袋微生物產(chǎn)氣性能驗證結果

分離菌株001～007接種滅菌土豆燒牛肉方便菜肴樣品，36 ℃培養(yǎng)3～7 d后，產(chǎn)氣脹袋實驗現(xiàn)象觀察結果如表2。

如表2所示，產(chǎn)品接種001、002（枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis）菌液和005、006（地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis）菌液3 d后開始出現(xiàn)產(chǎn)氣脹袋現(xiàn)象，繼續(xù)培養(yǎng)至第5 d和第7 d后觀察，產(chǎn)氣脹袋現(xiàn)象更加明顯。接種003、004（表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis）和007（凝結芽孢桿菌Bacillus coagulans）菌液的產(chǎn)品和空白對照在培養(yǎng)過程中沒有觀察到產(chǎn)氣脹袋現(xiàn)象。說明枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）是引起土豆燒牛肉方便菜肴產(chǎn)品脹袋的主要原因。

表2 脹袋微生物產(chǎn)氣脹袋驗證實驗結果

3 討論

方便菜肴是在傳統(tǒng)中式菜肴的基礎上，選取特定的加工工藝進行生產(chǎn)和殺菌，在保留原有色香味和營養(yǎng)價值的基礎上，還能夠在一定程度上延長食品的儲存期。方便菜肴憑借其方便、快捷、營養(yǎng)、衛(wèi)生、工業(yè)化等優(yōu)點，吸引了越來越多的消費者，其食品生產(chǎn)加工已成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展趨勢。但因為微生物污染，在貯藏期間，方便菜肴會出現(xiàn)脹袋和腐敗等較嚴重的質量與安全問題。

MALDI-TOF MS技術用于微生物菌種鑒定具有成本低、檢測時間短、鑒定準確性高、易于操作等優(yōu)點[15-16]。本研究以脹袋土豆燒牛肉方便菜肴微生物的分離和鑒定作為確認產(chǎn)品脹袋原因分析的依據(jù)，通過微生物分離、純化和形態(tài)學觀察得到7株菌，進一步利用MALDI-TOF-MS技術，驗證了形態(tài)學觀察和分子生物學技術的菌種鑒定結果，確認脹袋微生物為5株芽孢桿菌屬細菌和2株表皮葡萄球菌（見表1）。

芽孢桿菌屬細菌，是一類產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性細菌，好氧或兼性厭氧，能形成芽孢，存在于土壤、水、空氣等處，對高溫、紫外線、干燥、電離輻射和很多有毒的化學物質都有很強的耐受力，特別耐熱。食品加工中的滅菌或加熱工藝很難將其完全殺滅，該類菌是食品工業(yè)中較為重要的腐敗微生物。如高鵬等[17]從真空包裝肘花脹袋產(chǎn)品中分離鑒定芽孢桿菌屬和梭狀芽孢桿菌屬細菌是引起產(chǎn)品脹袋和腐敗變質的主要原因。李靖等[18]研究證明解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）是引起紅油豆瓣醬脹罐變質的主要因素。李慧等[13]從脹桶番茄醬中分離出了厚壁類芽孢桿菌（Paenibacilluscineris）、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）和蕈狀芽孢桿菌（Bacillus mycoides）。雖然這些產(chǎn)品與土豆燒牛肉方便菜肴生產(chǎn)工藝不盡相同，但相同的是豐富的營養(yǎng)成分給微生物提供了適宜的生長條件，導致這些微生物生長代謝產(chǎn)生氣體，最終導致產(chǎn)品脹袋和腐敗變質。本研究驗證了引起本批次方便菜肴產(chǎn)品脹袋現(xiàn)象發(fā)生的是枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

土豆燒牛肉方便菜肴產(chǎn)品生產(chǎn)原料較多，包括牛肉、土豆塊、調味品和香辛料等，加工過程包括清洗、切塊、炒制、包裝和殺菌等過程，生產(chǎn)過程分區(qū)操作，包裝和殺菌過程無菌控制。研究分離鑒定的7株菌中，兩株枯草芽孢桿菌具有很強的親緣關系，為同一來源的菌株，兩株地衣芽孢桿菌為不同來源的菌株，還有1株凝結芽孢桿菌和2株不同來源的表皮葡萄球菌。其中2株枯草芽孢桿菌和2株地衣芽孢桿菌可引起明顯的產(chǎn)氣脹袋現(xiàn)象（見表2）。因此，推斷加工原料和殺菌參數(shù)設置不合理是導致本研究土豆燒牛肉產(chǎn)品脹袋的主要原因。通過分析土豆燒牛肉方便菜肴脹袋微生物，有助于污染溯源分析，確認生產(chǎn)關鍵控制點，加強對原料驗收和生產(chǎn)加工過程關鍵環(huán)節(jié)的控制，并采用更科學的滅菌方法，避免經(jīng)濟損失和確保產(chǎn)品的質量與安全。

4 結論

本研究對脹袋土豆燒牛肉方便菜肴產(chǎn)品中的微生物進行分離、純化和鑒定。結果表明MALDI-TOF-MS技術可與微生物形態(tài)學觀察及分子生物學技術相結合用于脹袋食品污染微生物的快速及準確鑒定。從脹袋土豆燒牛肉方便菜肴產(chǎn)品中分離了7株菌，鑒定結果為2株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），為同一來源菌；2株表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis），為不同來源菌；2株地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），為不同來源菌；1株菌為凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）。產(chǎn)氣性能驗證實驗證明枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌與樣品的脹袋有直接關系。生產(chǎn)過程要加強原料驗收和殺菌參數(shù)的合理設置。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http://lyspkj.ijournal.cn/ch/index.axpx）、中國知網(wǎng)、萬方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫下載獲取。