羅 浩 吳志洪 鐘 江 張 衍 陳 娜

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，南寧市 530023，電子郵箱：luohao1943@163.com)

磷酸二酯酶4(phosphodiesterase 4,PDE4)由4個基因編碼，分別為PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D，因其能特異性水解，使細(xì)胞內(nèi)環(huán)腺苷酸濃度區(qū)域化，對下行信號傳導(dǎo)及各種細(xì)胞功能具有重要調(diào)控作用，可作為多種炎癥性疾病的潛在治療靶點，如哮喘、慢性阻塞性肺疾病、銀屑病及克羅恩病等[1-3]。本研究通過檢測特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis，AD)及銀屑病皮損中PDE4各亞型mRNA的表達情況，探討其在AD和銀屑病的發(fā)病機制中的作用。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 選取2017年11月至2018年9月于我院皮膚科門診就診的AD患者21例(AD組)，銀屑病患者19例(銀屑病組)及于我院激光美容科手術(shù)切除皮膚組織(未見病理改變)的患者15例(對照組)。AD診斷符合Williams診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，銀屑病診斷符合尋常性銀屑病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。所有研究對象近2個月內(nèi)未使用抗組胺藥物、類固醇皮質(zhì)激素、免疫調(diào)節(jié)劑等藥物，均排除心、腦、肺、腎臟器疾病及高血壓等疾患。AD組男性8例，女性13例，年齡(34.85±11.43)歲；銀屑病組男性12例，女性7例，年齡(37.62±13.37)歲；對照組男性4例，女性11例，年齡(35.51±10.29)歲。3組患者的性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均對本研究知情了解并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 實驗試劑與儀器：TRIzol購于美國Thermo公司(批號：15596-026)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Thermo Fisher公司(批號：K1622)，定量PCR檢測試劑盒購于QIAGEN公司(批號：208054)，RNA酶抑制劑購于ABI公司(批號：N8080119)，DNA酶購于NEB公司(批號：M0303S)，瓊脂糖(批號：A610013-0250)購于上海生工公司,熒光定量PCR儀購于ABI公司(型號：7500)。

1.2.2 引物的設(shè)計與合成：從GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)中檢索下載PDE4各基因亞型的核苷酸序列，用Primer 5.0引物設(shè)計軟件在保守區(qū)域進行特異性上、下游引物的設(shè)計，見表1。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 熒光定量PCR引物基因序列

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測PDE4各亞型相對表達水平：門診行病理活檢時取部分皮膚組織(以四肢皮損為主)，直徑約3～4 mm。皮損標(biāo)本采集后置于液氮速凍，-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。將凍存的皮損標(biāo)本進行液氮研磨，加入1 mL TRIzol使其裂解充分后加入200 μL氯仿，用力搖15 s，靜置5 min。4℃下12 000 r/min離心15 min。小心吸取上層水相，加入等量異丙醇混勻，靜置10 min。4℃下12 000 r/min離心10 min，棄上清。加入1 mL 75%乙醇，使沉淀懸浮，4℃下12 000 r/min離心10 min，棄上清。干燥沉淀5 min，加入20 μL經(jīng)焦碳酸二乙酯處理并經(jīng)高溫高壓消毒的超純水。去DNA操作：從離心管中取出上述液體2 μL，加入DNA酶0.2 μL、緩沖液1 μL、RNA酶抑制劑0.3 μL，加去酶水至10 μL，輕混勻，37℃溫育30 min,75℃熱變性10 min。反轉(zhuǎn)錄：使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA樣本逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為37℃ 15 min，98℃ 5 min，使酶失活后置于冰上。將逆轉(zhuǎn)錄好的cDNA稀釋10倍后行PCR檢測，反應(yīng)體系：2×濃縮的實時定量PCR擴增的預(yù)混液5 μL，引物A 0.5 μL，引物B 0.5 μL，熒光染料ROX 0.05 μL，模板cDNA 1 μL，無酶水2.95 μL，總體積10 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)。根據(jù)所得的Ct值，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內(nèi)參照，△Ct=(目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct)，△△Ct=各樣品ΔCt值-空白組ΔCt平均值；2-ΔΔCt計算PDE4各亞型的相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示，方差齊時，多組間比較采用方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊時，多組間和兩兩比較采用秩和檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，比較采用χ2檢驗。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

3組患者的PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D mRNA的相對表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。其中，AD組患者的PDE4B、PDE4D mRNA相對表達水平高于對照組(P<0.05)，而PDE4A、PDE4C mRNA相對表達水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；銀屑病組患者的PDE4A、PDE4D mRNA相對表達水平高于對照組(P<0.05)，而PDE4B、PDE4C mRNA相對表達水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；AD組與銀屑病組中，AD組患者皮損中PDE4B mRNA相對表達水平呈特異性高表達，銀屑病組患者皮損中PDE4A mRNA相對表達水平呈特異性高表達(P<0.05)。見表2。

表2 3組PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D mRNA的相對表達水平(x±s)

3 討 論

PDE4屬于磷酸二酯酶的重要亞型之一，主要存在于嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和CD4+淋巴細(xì)胞中[6]。PDE4家族由PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D這4個類似基因編碼的20多個亞型組成，作為PDE家族中水解環(huán)腺苷酸的一個最大群體，在環(huán)腺苷酸信號通路中占有重要地位。環(huán)腺苷酸作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，它的信號傳遞過程是通過環(huán)腺苷酸空間降解后形成細(xì)胞內(nèi)濃度差異，隨后細(xì)胞內(nèi)環(huán)腺苷酸與環(huán)腺苷酸效應(yīng)分子(如蛋白激酶A和環(huán)腺苷酸直接激活的交換蛋白Epac)結(jié)合，調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞過程[7]。PDE4通過水解環(huán)腺苷酸，可以控制多種細(xì)胞反應(yīng)，在哮喘、慢性阻塞性肺疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、銀屑病等疾病中發(fā)揮重要作用[6,8]。然而，PDE4各亞型的功能作用尚未得到證實，目前國內(nèi)外對PDE4各亞型的研究多集中在神經(jīng)系統(tǒng)領(lǐng)域。Pérez-Torres等[9]對人腦組織進行原位雜交免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，PDE4A、PDE4B、PDE4D廣泛分布在大腦皮層、海馬、腦干、丘腦和基底細(xì)胞節(jié)等結(jié)構(gòu)中，且在大腦不同結(jié)構(gòu)中的分布不同，PDE4C只局限地分布在皮層、小腦、丘腦等，這種分布差異表明PDE4各亞型可能具有不同的作用。Barber等[10]的研究結(jié)果顯示，與健康人相比，慢性阻塞性肺疾病患者血液單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中的PDE4A、PDE4B和PDE4D的轉(zhuǎn)錄水平明顯增高，PDE4C轉(zhuǎn)錄水平低于PDE4其他亞型的轉(zhuǎn)錄水平。Landells等[11]的研究證實，除PDE4C外，PDE4A、PDE4B和PDE4D在正常人和哮喘患者的CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞中大量存在。這些研究表明，在多種免疫細(xì)胞中(如嗜堿性細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、T細(xì)胞及單核細(xì)胞等)的PDE4可能以PDE4A、PDE4B和PDE4D這3個亞型為主。

Schafer等[8]通過檢測PDE4亞型在銀屑病外周血單核細(xì)胞及皮損中的分布情況，并評估成纖維細(xì)胞中PDE4/CD271復(fù)合物的功能，發(fā)現(xiàn)銀屑病患者外周血單核細(xì)胞中PDE4B及PDE4D mRNA表達水平較健康人群升高，在銀屑病病灶皮膚組織中，特別是內(nèi)皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞中，PDE4A及PDE4D mRNA的表達增加，表明PDE4及PDE4/CD271復(fù)合物在銀屑病成纖維細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)中起重要作用。本研究結(jié)果顯示，銀屑病組患者皮損中PDE4A、PDE4D mRNA相對表達水平高于對照組(P<0.05)，這與Schafer等[8]的研究結(jié)果相似。Huston等[12]研究證實PDE4A5基因的過表達可以保護成纖維細(xì)胞免受細(xì)胞凋亡。而成纖維細(xì)胞表型和功能的改變在銀屑病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[13-14]。本研究中，銀屑病皮損中PDE4A及PDE4D mRNA相對表達水平增高可能是阻止成纖維細(xì)胞凋亡，進而控制細(xì)胞的過度增生，維持表皮增生與凋亡動態(tài)平衡的一個保護性變化。

目前，皮膚屏障功能障礙是AD發(fā)病的首要機制。AD表皮的脂肪酸、膽固醇及神經(jīng)酰胺的合成減少，會導(dǎo)致角質(zhì)層的水分減少和皮膚屏障功能降低。皮膚的屏障功能還與皮膚炎癥有密切關(guān)系，當(dāng)皮膚屏障功能受損時，大量免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等的聚集和浸潤會促使多種促炎介質(zhì)釋放，從而導(dǎo)致皮膚炎癥反應(yīng)[15]。而PDE4B作為PDE4炎癥調(diào)控的主要亞型，在激活腫瘤壞死因子α反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，研究顯示，PDE4B缺陷小鼠在脂多糖刺激后出現(xiàn)PDE4B mRNA表達增高，PDE4活性增加，腫瘤壞死因子α分泌減少[16]，表明脂多糖激活PDE4B基因從而刺激腫瘤壞死因子α的分泌是構(gòu)成有效免疫反應(yīng)所必需的調(diào)節(jié)過程。國外多項研究發(fā)現(xiàn)PDE4D與整合素5結(jié)合可以減弱環(huán)腺苷酸/蛋白激酶A信號傳導(dǎo)，激活內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，且小鼠體內(nèi)敲除PDE4D后，動脈粥樣硬化易發(fā)部位的炎癥反應(yīng)減弱，表明整合素5與PDE4D的相互作用可能與細(xì)胞外基質(zhì)的重塑及炎癥密切相關(guān)[17-19]。PDE4B和PDE4D不僅具有重要的抗炎作用，其在脂肪代謝、蛋白質(zhì)合成中也起重要作用。研究顯示，脂肪細(xì)胞中PDE3B和PDE4D的過表達可導(dǎo)致基礎(chǔ)脂解率降低及胰島素誘導(dǎo)的脂解抑制作用增強，進而導(dǎo)致糖尿病代謝調(diào)節(jié)改變[20]。Avila等[21]發(fā)現(xiàn)，酒精能夠誘導(dǎo)肝臟PDE4尤其是PDE4B的表達增加，阻斷環(huán)腺苷酸信號傳導(dǎo)，肝臟細(xì)胞更易發(fā)生脂肪酸氧化損傷和脂肪變性。本研究中，AD組患者皮損組織中的PDE4B、PDE4D mRNA相對表達水平高于對照組(P<0.05)，因此我們推測AD組中PDE4B及PDE4D mRNA相對表達水平特異性增高可能涉及表皮炎癥和脂質(zhì)代謝過程。此外，AD組和銀屑病組相比，AD組患者皮損組織中的PDE4B mRNA相對表達水平呈特異性高表達，銀屑病組患者皮損組織中的PDE4A mRNA相對表達水平呈特異性高表達(P<0.05)，提示PDE4A與細(xì)胞的增殖和凋亡密切相關(guān)，PDE4B與細(xì)胞炎癥和脂質(zhì)代謝密切相關(guān)；而PDE4D在AD組與銀屑病組中的表達都明顯增高，提示PDE4D可能在調(diào)控表皮細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)中都發(fā)揮一定作用。

綜上所述，PDE4各亞型mRNA在AD及銀屑病皮損組織中的表達水平呈差異性，這種差異性表達可能在AD和銀屑病的發(fā)生及病情演變過程中發(fā)揮重要作用。目前已有多種PDE4抑制劑進入臨床實驗階段，但由于部分患者出現(xiàn)惡心、嘔吐等副反應(yīng)而被迫中止使用，而針對PDE4亞型的特異性抑制劑可能可以減輕或消除PDE4抑制劑的副反應(yīng)，具有廣闊的市場前景。