王錦秀 宋 勇,2 王新月 陳生熬,2 任道全,2*

（1塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

（2新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

葉爾羌高原鰍（Triplophysa yarkandensis）地方名為狗頭魚，隸屬鯉形目、鰍科、條鰍亞科、高原鰍屬、鼓鰾鰍亞屬，廣泛分布于塔里木河水系，是塔里木河水系優(yōu)勢種[1-2]。目前關(guān)于葉爾羌高原鰍的研究主要集中在形態(tài)學(xué)[3]、生長繁殖[4]和線粒體[5]等方面，與種群遺傳和分子標(biāo)記相關(guān)的研究還未見報(bào)道，種群遺傳信息的匱乏，將對其資源評估和有效地保護(hù)產(chǎn)生影響。

微衛(wèi)星，又稱短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats,STR）或簡單串聯(lián)重復(fù)序列（simple sequence repeats,SSR）[6]，微衛(wèi)星標(biāo)記具有多態(tài)性高、變異性強(qiáng)、數(shù)據(jù)易統(tǒng)計(jì)分析等突出優(yōu)點(diǎn)[7]，在各種分子遺傳標(biāo)記中，微衛(wèi)星DNA標(biāo)記技術(shù)受到許多研究者的青睞。魚類微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)中常用二堿基重復(fù)類型為主[8-9]，但也有學(xué)者認(rèn)為三堿基重復(fù)較二堿基重復(fù)具有更高的篩選效率和多態(tài)性[10-11]。高通量測序除具有二代測序高效、快捷的普遍特點(diǎn)外，其片段讀長更大，因此更適合于微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)[12]。

本研究基于高通量測序平臺對葉爾羌高原鰍基因組進(jìn)行隨機(jī)測序并挑選出100對含二、三堿基重復(fù)的微衛(wèi)星序列設(shè)計(jì)引物，探索最佳PCR反應(yīng)體系，篩選具有多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記，比較二、三堿基微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選效率和多態(tài)性差異，并檢測塔里木河支流五處采樣點(diǎn)的葉爾羌高原鰍野生群體的遺傳多態(tài)性，旨在為葉爾羌高原鰍的種群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分析提供技術(shù)基礎(chǔ)，為塔里木河特有魚類的保護(hù)積累資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與基因組DNA提取

葉爾羌高原鰍采集于塔里木河支流的五處采樣點(diǎn)，分別是阿克蘇河17尾，臺南河18尾，阿爾干25尾，臺特瑪湖15尾，車爾臣河27尾，共計(jì)102尾。每個(gè)樣品取20 mg鰭條，使用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（慈達(dá)生物技術(shù)有限公司,DP348）提取基因組織DNA。用核酸蛋白檢測儀（上海創(chuàng)萌生物科技有限公司,DS-11）檢測基因組DNA的濃度及純度，并用1%的瓊脂糖電泳檢測（BIO-RAD,164-5056），將提取純度較好的DNA-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 高通量測序與引物合成

采用HiSeq PE150模式（雙端測序）測序（上海生工），進(jìn)行基因組de novo組裝，在獲取拼接基因組序列后，使用MISA對序列中的SSR進(jìn)行了檢測，SSR最小間距為200 bp。隨機(jī)挑選100個(gè)二堿基重復(fù)、三堿基重復(fù)且重復(fù)次數(shù)在十次以上的微衛(wèi)星序列（真核生物基因組中，二堿基重復(fù)的微衛(wèi)星最為豐富，三堿基重復(fù)的微衛(wèi)星比二堿基重復(fù)微衛(wèi)星的含量低10倍，四堿基重復(fù)的微衛(wèi)星與之相比，含量更少[13]）進(jìn)行引物開發(fā)，送至公司進(jìn)行引物合成。

1.3 引物最佳退火溫度的篩選

葉爾羌高原鰍基因組DNA對100對SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出PCR反應(yīng)過程中的最佳退火溫度，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，并對引物進(jìn)行首輪篩選，篩選出瓊脂糖檢測能擴(kuò)增出穩(wěn)定且均一目的片段的SSR引物。PCR反應(yīng)體系總體積為30 μL，其組成為PCR Mix15 μL（天根，北京），DNA模板3 μL，上游引物Forward 1.5 μL，下游引物Reverse 1.5 μL，剩余體系雙蒸水補(bǔ)足。反應(yīng)條件95℃預(yù)變性3 min，94℃變性 30 s，退火 30 s（溫度 1：62℃、2：61.2℃、3：59.6℃、4：56.9℃、5：53.5℃、6：50.8℃、7：48.9℃、8：48℃），72℃延伸40 s，以上程序循環(huán)34次，最后72℃繼續(xù)延伸10 min。

1.4 引物多態(tài)性檢測

以8尾葉爾羌高原鰍個(gè)體的基因組DNA為模板對能夠擴(kuò)增出穩(wěn)定條帶的SSR引物進(jìn)行多態(tài)性篩選。PCR反應(yīng)體系同上，退火溫度為上步驟篩選得出。反應(yīng)產(chǎn)物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，經(jīng)0.1%硝酸銀染色后在化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（BIORAD ChemiDoc Imaging System）下拍照保存。將擴(kuò)增產(chǎn)物基于Fragment Analyzer 5200毛細(xì)電泳平臺進(jìn)行基因分型，檢測引物是否具有多態(tài)性，并得到微衛(wèi)星的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)（北京華世百奧生物技術(shù)有限公司）。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

原始數(shù)據(jù)通過CONVERT1.31軟件轉(zhuǎn)化為各軟件所需格式。利用Cervus3.03軟件計(jì)算出幾個(gè)群體葉爾羌高原鰍的等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、多態(tài)信息含量（PIC），利用PopGen32進(jìn)行群體內(nèi)Hardy-Weinberg平衡檢測。

2 結(jié)果

2.1 高通量測序結(jié)果與微衛(wèi)星位點(diǎn)分析

圖1 各堿基重復(fù)微衛(wèi)星序列所占比例

高通量測序共獲得27 802條存在微衛(wèi)星位點(diǎn)的序列，總長度為2 056 661 bp，最大長度為21 111 bp，最小長度為185 bp，平均長度為1 637 bp。圖1為葉爾羌高原鰍各堿基重復(fù)類型在所有微衛(wèi)星序列中所占的比例，其中單堿基重復(fù)是葉爾羌高原鰍最主要的微衛(wèi)星類型，占44.59%，其次二堿基、三堿基重復(fù)，占全部微衛(wèi)星序列的34.34%、12.46%，前三者占全部微衛(wèi)星序列的91.39%，而四堿基（2.53%）、五堿基（2.86%）、六堿基（5.22%）只占全部微衛(wèi)星序列的8.61%。同時(shí)在堿基類重復(fù)型中二堿基重復(fù)次數(shù)在6～61次，三堿基在5～31次，四堿基在7～27次、五堿基在6～12次，六堿基在5～17次，堿基數(shù)越大，重復(fù)次數(shù)逐漸減小，相應(yīng)微衛(wèi)星數(shù)量變少。

2.2 引物最佳退火溫度的選擇

100對引物中經(jīng)瓊脂糖檢測出能擴(kuò)增出穩(wěn)定且均一的目的片段的微衛(wèi)星引物共79對，有21對引物經(jīng)瓊脂糖檢測不能擴(kuò)增出穩(wěn)定且均一目的片段，兩條引物上的互補(bǔ)堿基相結(jié)合形成二聚合體，導(dǎo)致DNA無法與其相結(jié)合，使得擴(kuò)增效率降低，將其舍去。圖2為葉爾羌高原鰍部分引物（Y7、Y8、Y23、Y24）經(jīng)不同溫度（1：62℃、2：61.2℃、3：59.6℃、4：56.9℃、5：53.5℃、6：50.8℃、7：48.9℃、8：48℃）PCR后瓊脂糖電泳檢測結(jié)果。引物Y7在62℃、61.2℃、59.6℃、56.9℃、53.5℃、50.8℃條件下條帶較明亮且清晰，因此50.8～62℃均可成為引物Y7的最佳退火溫度；引物Y8在61.2℃條件下條帶明亮且清晰，因此將61.2℃設(shè)為引物Y8最佳退火溫度；引物Y23在59.6℃條件下條帶明亮且清晰，故61.2℃為Y23的最佳退火溫度；引物Y24在61.2℃、59.6℃條件下條帶明亮且清晰，將61.2℃設(shè)為Y24的最佳退火溫度，其余引物亦按此方法篩選。

圖2 葉爾羌高原鰍SSR引物瓊脂糖凝膠電泳

2.3 多態(tài)性檢測及引物信息

以8尾葉爾羌高原鰍個(gè)體的基因組DNA為模板，79對微衛(wèi)星引物中，只有33對引物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，條帶顯示出特異性，表示其具有多態(tài)性。圖3為部分引物（Y7、Y11、Y45）經(jīng)硝酸銀染色后得到的，引物Y7片段大小在203～238 bp，引物Y11片段大小在101～136 bp，引物Y45片段大小在188～212 bp，電泳后得到的目的片段出現(xiàn)條帶不同的現(xiàn)象，說明具有多態(tài)性，其余引物亦按此方法篩選。33對引物經(jīng)毛細(xì)電泳平臺進(jìn)行基因分型，得到微衛(wèi)星的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，如表1所示。

圖3 葉爾羌高原鰍SSR引物聚丙烯酰胺凝膠電泳

表1 葉爾羌高原鰍微衛(wèi)星位點(diǎn)及PCR引物信息

（續(xù)表）

2.4 葉爾羌高原鰍微衛(wèi)星位點(diǎn)的分離及多態(tài)性分析

33對多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)對102尾葉爾羌高原鰍進(jìn)行遺傳變異和遺傳多態(tài)性檢測，引物在葉爾羌高原鰍群體中進(jìn)行擴(kuò)增，得到群體的遺傳多樣性信息見表2。葉爾羌高原鰍的等位基因數(shù)介于24～52，有效等位基因數(shù)Ne介于4.040～30.626之間，平均等位基因和有效等位基因數(shù)分別為43.848、12.163。其中Y96位點(diǎn)的等位基因數(shù)最少，為 24，Y7、Y11、Y17、Y28、Y32、Y42、Y44、Y49等位點(diǎn)的等位基因數(shù)最多，為52。各個(gè)位點(diǎn)的香農(nóng)多樣性指數(shù)介于2.012～3.699之間，觀測雜合度Ho介于0～0.957之間，多態(tài)信息含量PIC介于0.729～0.972之間。對各位點(diǎn)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢測，發(fā)現(xiàn)有22個(gè)（67%）位點(diǎn)符合Hardy-Weinberg平衡（PHWE＞0.05），有11個(gè)（33%）位點(diǎn)顯著偏離 Hardy-Weinberg平衡（PHWE＜0.05）。與三堿基重復(fù)類型微衛(wèi)星相比，二堿基類型微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性無論是等位基因數(shù)Na、觀測雜合度Ho，還是多態(tài)信息含量PIC等參數(shù)都明顯比三堿基重復(fù)類型的高。

表2 葉爾羌高原鰍微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳學(xué)特征

（續(xù)表）

3 討論

不同引物的退火溫度不一樣，從特異性和條帶數(shù)量角度考慮，確定合適的退火溫度十分必要[14]。本研究中葉爾羌高原鰍100對引物的退火溫度也不同，能擴(kuò)增出穩(wěn)定條帶的79對微衛(wèi)星引物退火溫度大多在56.9～62℃效果較好，說明其引物的最佳退火溫度在56.9～62℃范圍內(nèi)，高于西昌華吸鰍（Sinogastromyzon sichangensis）[15]51～60℃的退火溫度，中華金沙鰍（Jinshaia sinensis）[16]的退火溫度在 51～57℃之間，長體圓鲹（Decapterus macrosoma）[17]退火溫度在55～60℃之間，塔里木裂腹魚（Schizothorax bid-dulphi）[18]的退火溫度在 54～57℃之間，不同種類魚類退火溫度不盡相同，這可能與其序列所含堿基的比例相關(guān)，有待進(jìn)一步研究。從本研究的結(jié)果可以看出，一二三堿基是葉爾羌高原鰍的主要微衛(wèi)星堿基類型，四五六堿基類型相對較少，隨堿基數(shù)量的增加，微衛(wèi)星數(shù)量逐漸減少的現(xiàn)象，這與Chistiakov、屈政委、黃杰[19-21]等學(xué)者研究的微衛(wèi)星組成情況類似，說明在葉爾羌高原鰍微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)中二三堿基是主要的篩選對象。在堿基類重復(fù)型中二堿基重復(fù)次數(shù)在6～61次，三堿基在5～25次，四堿基在7～27次、五堿基在6～12次，六堿基在5～17次，發(fā)現(xiàn)堿基數(shù)越大，重復(fù)次數(shù)越小，這與呂振明[22]等研究的曼氏無針烏賊微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選的結(jié)果一致。從具有多態(tài)性的33對微衛(wèi)星標(biāo)記中發(fā)現(xiàn)二三堿基重復(fù)類型微衛(wèi)星相比，二堿基類型微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性無論是等位基因數(shù)Na、觀測雜合度Ho、多態(tài)信息含量PIC等參數(shù)都明顯比三堿基高，這與房祖業(yè)[13]等研究大刺鰍二、三、四堿基重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選結(jié)果一致，這也提示了更為有效的篩選多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記，二堿基類型將是首先篩選的對象。

多態(tài)信息含量PIC是評價(jià)微衛(wèi)星位點(diǎn)的重要參考標(biāo)準(zhǔn)，PIC＞0.5表明該位點(diǎn)具有較高的多態(tài)性，0.25＜PIC＜0.5表明該位點(diǎn)具有中度多態(tài)性，PIC＜0.25表明該位點(diǎn)具有低度多態(tài)性[23]。張智等[15]等對利用高通量測序法對西昌華吸鰍基因組進(jìn)行測序并篩選出29對具有多態(tài)性的引物，平均等位基因數(shù)為14.5，觀測雜合度（Ho）和期望雜合度（He）分別為0.620和0.882，多態(tài)信息含量（PIC）為0.859，引物在西昌華吸鰍中表現(xiàn)出較高的多態(tài)性。李薇[24]等通過高通量測序成功篩選出達(dá)氏鱘（Acipenser dabryanus）25個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)（Na）為4～11（平均值7.2），觀測雜合度（Ho）為0.160～1.000（平均值0.744），期望雜合度（He）為0.346～0.875（平均值0.727），除了其中一個(gè)位點(diǎn)以外，所有位點(diǎn)的多態(tài)信息含量（PIC）均大于0.5，其多態(tài)性較好。本研究基于高通量測序技術(shù)共篩選出33對具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)，并用于檢測塔里木河干流葉爾羌高原鰍野生群體的遺傳多態(tài)性，其多態(tài)信息含量PIC介于0.729～0.927之間，表明這33個(gè)位點(diǎn)均具有多態(tài)性（PIC＞0.5），塔里木河支流葉爾羌高原鰍野生群體具有較高的遺傳多樣性。33個(gè)位點(diǎn)中有11個(gè)位點(diǎn)顯著偏離Hardy-Weinberg平衡，這種現(xiàn)象可能與樣本量及無效等位基因的存在有關(guān)[25]。由于微衛(wèi)星標(biāo)記具有通用性，本文篩選出葉爾羌高原鰍的微衛(wèi)星引物，同樣可用于其他高原上的鰍科魚類，亦可參照此引物來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。

4 結(jié)論

本研究的結(jié)果表明，基于de novo的高通量測序技術(shù)是開發(fā)葉爾羌高原鰍微衛(wèi)星標(biāo)記的理想方法。與傳統(tǒng)的DNA建庫和探針雜交富集法開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記相比，具有快速、高效等優(yōu)點(diǎn)。本研究表明二堿基重復(fù)類型的微衛(wèi)星標(biāo)記在葉爾羌高原鰍中占優(yōu)勢，多態(tài)性較好，且本研究篩選的33對多態(tài)性引物可以應(yīng)用于群體間遺傳多樣性、遺傳距離和遺傳圖譜的構(gòu)建，以及親緣關(guān)系的鑒定等方面，為葉爾羌高原鰍種質(zhì)資源保護(hù)研究奠定分子基礎(chǔ)。