吳自豪 呂俊凡 廖光華 任 強(qiáng) 陳 偉,*

（1塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

（2新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

奶牛乳腺炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)中常見(jiàn)造成奶牛養(yǎng)殖業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失的疾病之一，其可引起奶牛中原料奶的產(chǎn)量、品質(zhì)下降，同時(shí)嚴(yán)重危害奶牛的健康[1-2]。奶牛乳腺炎是我國(guó)奶牛發(fā)病情況最為頻繁的疾病之一，發(fā)病率達(dá)20%～70%，其中臨床型乳房炎的發(fā)病率為 9.7%～55.6%，隱性乳腺炎的發(fā)病率為61.03%～79.62%[3]。研究表明，奶牛隱性乳腺炎的臨床癥狀與病原菌的生存方式密切相關(guān)，其中引起奶牛乳腺炎的一個(gè)重要病原菌是金黃色葡萄球菌[4]。金黃色葡萄球菌是一種普遍存在的人畜共患菌[5-6]，可在人和動(dòng)物間交叉?zhèn)鞑?，不僅會(huì)引起畜禽的疾病，還會(huì)對(duì)人類(lèi)健康造成威脅。近年來(lái)金黃色葡萄球菌的耐藥性呈增高趨勢(shì)，并且隨著耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistantStaphylococcus aureusMRSA）菌株的出現(xiàn)[7]，給金黃色葡萄球菌的防治帶來(lái)極大困難。因此，了解和掌握金黃色葡萄球菌的藥物敏感性，對(duì)指導(dǎo)臨床用藥具有十分重要的意義。

基因分型在確定病原菌、菌株分型和了解菌株間的相關(guān)性，探究菌株分型與藥物敏感關(guān)系等方面具有重要意義。多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）[8]是近年來(lái)廣泛運(yùn)用的一種分子分型方法，以7個(gè)持家基因（arcC,aroE,glpF,gmk,pta,tpi,yqiL）PCR片段序列的多態(tài)性分析為基礎(chǔ)，比較它們的等位基因譜。MLST建有大型數(shù)據(jù)庫(kù)的國(guó)際網(wǎng)站，可在線分析菌株的遺傳相關(guān)性，重復(fù)性好[9]。本研究擬對(duì)新疆南疆地區(qū)奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌進(jìn)行MLST分子分型和藥物敏感性研究，探索MLST分型與耐藥性之間的關(guān)系，為防治奶牛隱性乳腺炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集與菌株

對(duì)來(lái)自新疆巴州地區(qū)某奶牛場(chǎng)的經(jīng)蘭州隱性乳腺炎檢測(cè)法（LMT）檢測(cè)出的8頭患有隱性乳腺炎的奶牛，每個(gè)乳區(qū)使用醫(yī)用酒精擦拭消毒，棄去前期擠出的乳樣后，用無(wú)菌試管收集每個(gè)乳區(qū)的乳樣10 mL，共17份乳樣，保存于4℃冰盒。金黃色葡萄球菌ATCC25923由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑及儀器

金黃色葡萄球菌的7個(gè)持家基因（arcC,aroE,glpF,gmk,pta,tpi,yqiL）擴(kuò)增引物[10]、nuc基因擴(kuò)增引物[11]（見(jiàn)表 1）、Tris、SDS、EDTA、dNTP、Easy Taq 酶、Easy Taq buffer，均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀購(gòu)自Bio-Rad公司；藥敏片頭孢西丁（CFX）、頭孢噻吩（CF）、諾氟沙星（NOR）、慶大霉素（GM）、克林霉素（CM），均購(gòu)自溫州市泰康生物科技有限公司。健康兔血清由塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

MSA/MSB培養(yǎng)基用于選擇性劃線分離培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，TSA/TSB培養(yǎng)基用于金黃色葡萄球菌的增殖培養(yǎng)，MHA/MHB培養(yǎng)基用于K-B紙片法藥敏試驗(yàn)。

表1 引物名稱(chēng)及序列

1.2 方法

1.2.1 葡萄球菌的分離

吸取50 μL牛乳分別加入5 mL MSB/TSB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24～36 h后，劃線接種到MSA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18～24 h。挑取大而圓、邊緣整齊、表面光滑、中度隆起的金黃色或乳白色菌落，進(jìn)行革蘭染色、鏡檢，呈葡萄串狀、革蘭染色陽(yáng)性的菌保存于20%甘油管，-80℃貯存。

1.2.2 金黃色葡萄球菌的生化鑒定

1.2.2.1 觸酶試驗(yàn)

在一張潔凈的載玻片上滴加少量3%H2O2，用接種環(huán)挑取少量待檢細(xì)菌菌落，混勻于3%H2O2中，30 s內(nèi)觀察有無(wú)氣泡產(chǎn)生。如果產(chǎn)生氣泡，則為陽(yáng)性（+），反之則為陰性（-）[12]。以金黃色葡萄球菌ATCC25923、生理鹽水分別做陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

1.2.2.2 血漿凝固酶試驗(yàn)

潔凈的1.5 mL離心管中加入1:10的兔血漿1 mL，然后加入在37℃恒溫中培養(yǎng)18～24 h的菌懸液100 μL，將其充分混勻，并置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定時(shí)觀察。如果培養(yǎng)物凝集成膠凍狀，則為陽(yáng)性（+），反之則為陰性（-）[12]。以金黃色葡萄球菌ATCC25923、生理鹽水分別做陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

1.2.2.3 甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)

取分離株接種于高鹽甘露醇瓊脂（MSA）培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18～24 h后觀察。如果菌落周?chē)腗SA由紅色變?yōu)辄S色則表示甘露醇發(fā)酵為陽(yáng)性（+），未發(fā)生變化則表示甘露醇發(fā)酵為陰性（-）。以金黃色葡萄球菌ATCC25923做陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3 金黃色葡萄球菌的nuc基因擴(kuò)增鑒定

通過(guò)鏡檢篩選為葡萄球菌的菌株全部進(jìn)行nuc基因擴(kuò)增，同時(shí)以金黃色葡萄球菌ATCC25923作陽(yáng)性對(duì)照，擴(kuò)增產(chǎn)物大小在279 bp且為單一明亮條帶的菌株確定為金黃色葡萄球菌[11]。

1.2.4 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)生化鑒定和nuc基因擴(kuò)增結(jié)果，采用K-B紙片法對(duì)鑒定為金黃色葡萄球菌的菌株進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)，按美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)指南（CLSI,2017）標(biāo)準(zhǔn)操作。將在MHB中37℃條件下恒溫培養(yǎng)6～8 h的細(xì)菌混懸液，用MHB稀釋至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)，然后使用無(wú)菌棉簽蘸取菌液均勻涂布于MHA上，貼藥敏片，同時(shí)使用標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌ATCC25923作為質(zhì)控菌株。質(zhì)控菌株抑菌圈直徑在質(zhì)控范圍內(nèi)可對(duì)待測(cè)菌株進(jìn)行藥物敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定，根據(jù)指南判斷細(xì)菌對(duì)5種藥物的敏感程度，可分為敏感、中介、耐藥，判斷標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 藥物敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.5 多位點(diǎn)序列分子分型（MLST）

通過(guò)PCR擴(kuò)增金黃色葡萄球菌的7個(gè)持家基因（arcC,aroE,glpF,gmk,pta,tpi,yqiL），擴(kuò)增引物序列與片段預(yù)期大小如表1所示。依據(jù)不同菌株持家基因內(nèi)部位點(diǎn)存在不同程度的突變，將序列在MLST官方網(wǎng)站（https://pubmlst.org/saureus/）進(jìn)行對(duì)比，獲得菌株序列型。本實(shí)驗(yàn)采用50 μL PCR擴(kuò)增體系：ddH2O（40.7 μL）、Easy Taq 酶（0.3 μL）、Easy Taq buffer（5 μL）、dNTP（1 μL）、上下游引物各1 μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s、54℃退火45 s、72℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán)，72℃最后延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌的分離鑒定

從17份隱性乳腺炎乳樣品中分離出46株呈葡萄串狀、革蘭染色陽(yáng)性的菌株，經(jīng)生化試驗(yàn)及nuc基因擴(kuò)增鑒定得到金黃色葡萄球菌25株。25株金黃色葡萄球菌生化試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表3所示。

表3 25株金黃色葡萄球菌鑒定結(jié)果

2.2 藥物敏感性檢測(cè)

對(duì)25株金黃色葡萄球菌進(jìn)行5種抗生素的藥物敏感性檢測(cè)。頭孢類(lèi)抗生素2種：頭孢噻吩（CF）、頭孢西丁（CFX）；林可酰胺類(lèi)抗生素1種：克林霉素（CM）；氨基糖苷類(lèi)抗生素1種：慶大霉素（GM）；喹諾酮類(lèi)抗菌藥1種：諾氟沙星（NOR）。結(jié)果表明，25株金黃色葡萄球菌具有不同程度的耐藥性，耐藥菌株中部分菌株為多重耐藥。25株菌株對(duì)諾氟沙星和克林霉素的耐藥率最高，為36%；其次為慶大霉素，耐藥率為28%；對(duì)頭孢西丁以及頭孢噻吩的耐藥率均為0%。其中對(duì)三種藥物（CM、NOR、GM）耐藥的菌株有7株（28%），對(duì)兩種藥物（CM、NOR）耐藥的菌株有2株（8%）（結(jié)果見(jiàn)表4）。

表4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.3 MLST分型

通過(guò)MLST分型分析，結(jié)果表明25株金黃色葡萄球菌分別屬于 7個(gè) STs：ST398（36%）、ST22（20%）、ST5405（16%）、ST5406（16%）、ST5812（4%）、ST5819（4%）、ST5820（4%）；其中ST5812、ST5819、ST5820為本研究中發(fā)現(xiàn)的新STs（表5）。

表5 MLST分型結(jié)果

表6 MLST分型與5種抗生素耐藥性的關(guān)系

3 討論

金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎對(duì)奶牛產(chǎn)業(yè)造成巨大影響，且奶牛隱性乳腺炎中的金黃色葡萄球菌可作為食源性病原菌威脅人類(lèi)健康[13]。金黃色葡萄球菌的種內(nèi)分型較多，尤其是近年來(lái)MRSA的不斷出現(xiàn)，使臨床用藥更加困難。因此，探索金黃色葡萄球菌種內(nèi)分型與藥物敏感性的關(guān)系，對(duì)臨床精準(zhǔn)用藥具有十分重要的意義。本研究采用MLST的分型方法，對(duì)來(lái)自隱性乳腺炎奶樣的25株金黃色葡萄球菌進(jìn)行分子分型，同時(shí)檢測(cè)對(duì)五種抗生素的敏感性。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究中的菌株對(duì)頭孢類(lèi)藥物敏感，而對(duì)林可酰胺類(lèi)抗生素、氨基糖苷類(lèi)抗生素和喹諾酮類(lèi)抗菌藥均產(chǎn)生了耐藥性。本研究所確定的7個(gè)序列型中，屬于6種ST型（ST22、ST5405、ST5406、ST5812、ST5819和 ST5820）的所有菌株對(duì) 5種藥物均敏感。而屬于ST398型的9株菌株均存在對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素（慶大霉素，77.78%）、林可酰胺類(lèi)抗生素（克林霉素，100%）、喹諾酮類(lèi)抗菌藥（諾氟沙星，100%）的多重耐藥現(xiàn)象（如表6所示）。表明金黃色葡萄球菌的MLST分型與藥物敏感性存在正相關(guān)。

本研究從新疆巴州地區(qū)隱性乳腺炎奶樣分離獲得的金黃色葡萄球菌屬于7個(gè)STs，其中3個(gè)為本研究發(fā)現(xiàn)的新序列型。本課題組在前期研究中從新疆巴州地區(qū)奶樣中分離的金黃色葡萄球菌屬于18個(gè)STs，除了ST398為兩項(xiàng)研究共有的序列型外，其余17個(gè)序列型均與本研究確定的序列型不同，且也為本課題組發(fā)現(xiàn)的新序列型[14]，說(shuō)明巴州地區(qū)乳源金黃色葡萄球菌分子分型具有多樣性，值得進(jìn)一步研究。與來(lái)自新疆其他7個(gè)地區(qū)的12個(gè)STs[10]相比，本研究分離的金黃色葡萄球菌MLST分型結(jié)果完全不同，沒(méi)有任何一個(gè)相同的序列型。說(shuō)明地域不同，金黃色葡萄球菌分子分型截然不同。與新疆地區(qū)以外的省市相比，有學(xué)者從北京市奶源中分離的金黃色葡萄球菌屬于5種STs[15]，其中僅ST398為本研究共有的序列型。上述研究結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌種內(nèi)分子分型具有復(fù)雜的多樣性。不同地域的菌株分子分型差異明顯，即使是相同地區(qū)，也有多種不同的分子分型。而金黃色葡萄球菌不同分子分型與抗菌藥物敏感性之間呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，因此給臨床用藥帶來(lái)很大困難[14]。

在金黃色葡萄球菌的MLST分型研究中，ST398型金黃色葡萄球菌在食品衛(wèi)生和公共衛(wèi)生安全方面具有重要意義。ST398型金黃色葡萄球菌來(lái)源于多種畜禽，且可從國(guó)內(nèi)外多個(gè)地區(qū)分離獲得，是食源性金黃色葡萄球菌污染動(dòng)物性食品的重要序列型，可引起人類(lèi)的嚴(yán)重感染[16-20]。具有多重耐藥表型的ST398型金黃色葡萄球菌，如ST398型MRSA，可對(duì)公共衛(wèi)生和人類(lèi)疾病治療造成威脅[17]。在本研究中，分離獲得9株ST398型金黃色葡萄球菌，雖然對(duì)甲氧西林敏感，但仍具有多重耐藥的表型，具有潛在的公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)。

本研究在鑒定金黃色葡萄球菌的過(guò)程中，分離獲得1株不發(fā)酵甘露醇的金黃色葡萄球菌。甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)是鑒定金黃色葡萄球菌的重要生化實(shí)驗(yàn)[21]，也是衡量金黃色葡萄球菌致病性的重要依據(jù)。金黃色葡萄球菌甘露醇發(fā)酵與其生理代謝、毒力產(chǎn)生及致病性有一定的關(guān)系[22]，但其機(jī)制尚未明確。但近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，許多分離自慢性感染或長(zhǎng)期感染的金黃色葡萄球菌并不發(fā)酵甘露醇，如金黃色葡萄球菌的小菌落變異體（Small Colony Variants,SCVs）[23]。不發(fā)酵甘露醇的金黃色葡萄球菌，其致病性往往較低，可能引發(fā)長(zhǎng)期和慢性感染，給臨床用藥帶來(lái)困難。因此，深入研究甘露醇代謝途徑，尤其是甘露醇發(fā)酵機(jī)制，有望為新型抗菌藥物研發(fā)提供新的思路。