熱衣汗·玉素甫 賈萬(wàn)忠 閆鴻斌 吳耀東 吳燕濤 高佳敏李蓮瑞 石長(zhǎng)青*

（1塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

（2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730000）

細(xì)粒棘球蚴?。‥chinococcosis）又稱(chēng)包蟲(chóng)病，是由細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)（Echinococcus granuloses）的中絳期幼蟲(chóng)—細(xì)粒棘球蚴，寄生在人和動(dòng)物的肝、肺和其他器官所導(dǎo)致的一種人畜共患寄生蟲(chóng)病。主要引起寄生部位機(jī)械性壓迫、毒素作用和過(guò)敏反應(yīng)等。該病呈世界性分布，主要在以畜牧業(yè)發(fā)展為主國(guó)家和地區(qū)流行，全球至少有100個(gè)國(guó)家存在包蟲(chóng)病疫情，被OIE列為法定報(bào)告動(dòng)物疾病，在我國(guó)被列為人畜共患二類(lèi)動(dòng)物疫病[1]。我國(guó)是包蟲(chóng)病的高發(fā)國(guó)家之一，嚴(yán)重流行地區(qū)包括新疆、青海、甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古、西藏和四川等7個(gè)省和自治區(qū)，占全國(guó)面積的44%[2]。

該調(diào)查在北疆昌吉、阿勒泰、伊犁地區(qū)的牛羊屠宰場(chǎng)采集肝肺細(xì)粒棘球蚴包囊組織，對(duì)其線(xiàn)粒體細(xì)胞色素氧化酶亞單位Ⅰ基因（cox1）和線(xiàn)粒體NADH脫氫酶Ⅰ基因（nad1）的核苷酸序列進(jìn)行分析，以期闡明北疆三個(gè)地區(qū)細(xì)粒棘球蚴病的流行情況和種群的遺傳與變異特征。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年4月至2019年9月，在北疆昌吉、阿勒泰、伊犁三個(gè)地區(qū)牛羊定點(diǎn)屠宰場(chǎng)，對(duì)牛羊肝臟和肺臟進(jìn)行細(xì)粒棘球蚴包囊采集。將采集的包囊囊液、生發(fā)層、原頭節(jié)分別裝于離心管，保存于-80℃冰箱，備用。

1.2 主要試劑

基因組提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京），Prime STAR HS（premix）（TAKARA，日本），Gel Red核酸染料（BIOTIUM，美國(guó)），引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 基因組提取

用基因組提取試劑盒按照產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū)對(duì)處理后的包囊樣本生發(fā)層進(jìn)行基因組DNA提取，提取的DNA于-20℃保存，備用。

1.3.2cox1和nad1基因PCR擴(kuò)增與序列測(cè)定

以基因組為模板，用于擴(kuò)增線(xiàn)粒體cox1和nad1基因部分序列的保守引物序列為Ohiolei等[3]實(shí)驗(yàn)中使用的兩對(duì)引物。用于擴(kuò)增cox1基因的上游引物：5′-ATTATAGAAAATTTTCGTTTTACACGC-3′，下游引物：5′-AAGCATGATGCAAAAGGCAAATAAACC-3′。用于擴(kuò)增nad1基因的上游引物：5′-ATTATAGAAAATTTTCGTTTTACACGC-3′，下游引物5′-ATTCACAATTTACTATATCAAAGTAACC-3′。反應(yīng)體系為 Prime STAR HS（premix）12.5 μl，上、下游引物各 1 μl，模板 1 μl，用去離子水補(bǔ)齊為 25 μl，混勻并短暫離心。PCR程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，98℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)，72℃再延伸10 min。同時(shí)，以ddH2O代替模板DNA作為空白對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μl的點(diǎn)樣緩沖液混合，在1.2%瓊脂糖凝膠中，以1×TAE緩沖液電泳。電泳結(jié)束后，用凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察目的基因條帶，記錄陽(yáng)性鑒定結(jié)果并拍照保存，將陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

從成功測(cè)序的樣品選取cox1和nad1基因的1 649 bp和894 bp的核苷酸序列，通過(guò)BLAST比對(duì)判斷基因型，再使用UGENE與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)G1、G3、G4、G5、G6、G7、G8基因型及多房棘球絳蟲(chóng)（E.multilocularis）、少節(jié)棘球絳蟲(chóng)（E.oligarthra）、石渠棘球絳蟲(chóng)（E.shiquicus）、伏氏棘球絳蟲(chóng)（E.vogeli）、獅棘球絳蟲(chóng)（E.felidis）、泡狀帶絳蟲(chóng)（Taenia.hydatigena）的參考序列進(jìn)行比對(duì)。利用Dna SP分別對(duì)cox1和nad1基因序列分析單倍型，再利用MEGA5 對(duì)cox1和nad1的所有單倍型序列分別構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。利用Popart對(duì)cox1和nad1基因的所有單倍型分別構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 不同地區(qū)細(xì)粒棘球蚴感染情況

通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)采集樣本，從昌吉、阿勒泰、伊犁三個(gè)地區(qū)210頭牛和2 294只綿羊分別采集24、8、24份臟器的40、13、25個(gè)疑似包囊樣本；確診宿主40例，確診包囊樣本共有62個(gè)，平均感染率為1.60%；其余包囊已鈣化，其中牛源鈣化囊占60%（3/5）、綿羊源鈣化囊占25.49%（13/51）；1頭牛和13只綿羊包囊樣本中可以分離出原頭節(jié)，為可育囊。昌吉的細(xì)粒棘感染率最高，感染率為3.85%（24/624）；其次是伊犁，感染率為0.87%（10/1 144）；阿勒泰的感染率最低，感染率為0.82%（6/736）（表1）。

表1 不同地區(qū)牛羊細(xì)粒棘球蚴感染情況

2.2 細(xì)粒棘球蚴基因型的確定

PCR產(chǎn)物電泳后，使用凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察，共36只綿羊和4頭牛的樣本可觀(guān)察到目的條帶，其中源自37個(gè)宿主的57個(gè)包囊樣本呈現(xiàn)cox1基因擴(kuò)增條帶陽(yáng)性（1 800 bp處）；源自39個(gè)宿主的59個(gè)包囊樣本呈現(xiàn)nad1基因擴(kuò)增條帶陽(yáng)性（1 400 bp處）。經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì)，cox1和nad1基因測(cè)序結(jié)果均為G1基因型。

2.3 細(xì)粒棘球蚴單倍型特征

將PCR擴(kuò)增成功的57條cox1基因序列和59條nad1基因序列進(jìn)行單倍型分析。利用Dna SP分析，本試驗(yàn)中57個(gè)包囊樣本cox1基因序列歸為25個(gè)單倍型，將它們命名為Hap1至Hap25，并將它們連同其他基因型和其他蟲(chóng)種一起構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖1）。阿勒泰地區(qū)羊肝臟（ALTY26）樣本的6個(gè)包囊樣本、昌吉地區(qū)羊肺臟（CJY34）樣本的2個(gè)包囊樣本勻歸為Hap1；昌吉地區(qū)羊肝臟（CJY16）樣本的10個(gè)包囊樣本歸屬4個(gè)不同的單倍型，它們分別是 Hap4（6/10）、Hap5（1/10）、Hap6（2/10）、Hap12（1/10）；昌吉地區(qū)羊肝臟（CJY11）樣本的4個(gè)包囊樣本都屬于單倍型Hap10；從昌吉地區(qū)羊肝、肺臟（CJY8）樣本分別采集的2個(gè)包囊樣本都?xì)w屬于單倍型Hap21；從伊犁地區(qū)羊肝、肺臟（YNY39）樣本分別采集的2個(gè)包囊樣本分別歸為單倍型Hap13和Hap25（表 2）。

本試驗(yàn)中59個(gè)包囊樣本nad1基因共有8個(gè)單倍型，命名為Hap1至Hap8，并將它們連同其他基因型和其他蟲(chóng)種一起構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2）。阿勒泰地區(qū)羊肝臟（ALTY26）樣本的6個(gè)包囊、昌吉地區(qū)羊肺臟（CJY34）樣本的4個(gè)包囊、昌吉地區(qū)羊肝臟（CJY11）樣本的3個(gè)包囊、昌吉地區(qū)羊肝、肺臟（CJY8）樣本的分別2個(gè)包囊、伊犁地區(qū)羊肝、肺臟（YNY39）樣本的分別2個(gè)包囊都?xì)w類(lèi)為單倍型Hap1；昌吉地區(qū)羊肝臟（CJY16）樣本的9個(gè)包囊分別歸屬于單倍型 Hap1（2/9）、Hap3（5/9）、Hap4（2/9）（表2）

圖1 cox1基因單倍型進(jìn)化樹(shù)

圖2 nad1基因單倍型進(jìn)化樹(shù)

cox1基因單倍型以Hap1為主，占26.32%（15/57），其中Hap1單倍型在阿勒泰包囊樣本中占70%（7/10），在昌吉包囊樣本中占18.91%（7/37）、在伊犁包囊樣本中占10%（1/10）；Hap2、Hap3、Hap7只發(fā)現(xiàn)于阿勒泰包囊樣本中；Hap13、Hap18、Hap23-25只發(fā)現(xiàn)于伊犁包囊樣本中；其余單倍型只發(fā)現(xiàn)于昌吉包囊樣本中（表2）。nad1基因單倍型以Hap1為主，占77.97%（46/59），其中阿勒泰包囊樣本占90%（9/10）、昌吉包囊樣本占68.42%（26/38）、伊犁包囊樣本占100%（11/11）；Hap3-8單倍型只發(fā)現(xiàn)于昌吉包囊樣本中（表2）。

表2 cox1和nad1基因序列單倍型歸屬及樣本分布

2.4 cox1和nad1基因單倍型網(wǎng)絡(luò)圖特征

根據(jù)cox1基因單倍型網(wǎng)絡(luò)圖（圖3-a）所示：Hap1是網(wǎng)絡(luò)圖中心，其他單倍型由Hap1連接；在網(wǎng)絡(luò)圖中，Hap1是最大單倍型群體，Hap12、Hap18、Hap24與Hap1遺傳距離較遠(yuǎn)，并有相似遺傳距離，表明它們遺傳相關(guān)性很弱；與Hap12遺傳距離最近的是Hap5，因此 Hap12可能是 Hap5的分支；Hap18、Hap17與Hap23有一個(gè)突變位點(diǎn)位置相同，但Hap23的突變方式不同；Hap13與Hap10、Hap14有一個(gè)相同突變位點(diǎn)，同時(shí)Hap13與Hap9有一個(gè)相同突變位點(diǎn)；Hap14與Hap10遺傳距離最近，因此Hap14可能是Hap10的分支；Hap1與Hap3、Hap14、Hap17、Hap21、Hap24之間有兩個(gè)突變位點(diǎn)，Hap1與Hap13、Hap15之間有三個(gè)突變位點(diǎn)。

根據(jù)nad1基因單倍型網(wǎng)絡(luò)圖（圖3-b）所示：Hap1是網(wǎng)絡(luò)圖中心，其他單倍型由Hap1連接；在網(wǎng)絡(luò)圖中，Hap1是最大單倍型群體，Hap1與Hap5、Hap6之間有兩個(gè)突變位點(diǎn)，表明它們遺傳相關(guān)性較弱；單倍型Hap2、Hap3、Hap4、Hap7和Hap8與Hap1只有一個(gè)突變位點(diǎn)，表明它們遺傳距離較近；單倍型Hap2由2個(gè)樣本的序列組成，它們分別來(lái)自阿勒泰和昌吉地區(qū)的包囊樣本。

圖3 cox1和nad1基因單倍型網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

本調(diào)查結(jié)果顯示，阿勒泰、伊犁和昌吉三個(gè)地區(qū)牛羊包蟲(chóng)病感染率分別為0.82%、0.87%、3.85%，明顯低于2012年呂建忠等和2014年努斯來(lái)提·依不拉音等的調(diào)查[4-5]。主要原因是近年來(lái)政府和相關(guān)部門(mén)大力宣傳，農(nóng)牧民防范意識(shí)增強(qiáng)，包蟲(chóng)病獲得有效控制。另外，棘球蚴經(jīng)過(guò)1年左右的時(shí)間才能發(fā)育為肉眼可見(jiàn)的包囊[6]，多數(shù)羊被感染后在發(fā)育為棘球蚴包囊之前就已經(jīng)被屠宰，這可能也是本次調(diào)查感染率低的原因。該調(diào)查采集牛、綿羊宿主（5、51）的包囊樣本，其中牛源鈣化囊占60%（3/5）、綿羊源鈣化囊占25.49%（13/51）；1頭牛和13只綿羊的包囊樣本中可以分離出原頭節(jié)，為可育囊。結(jié)果表明牛包囊鈣化率比綿羊高，綿羊可育囊比牛多，這是由于綿羊?yàn)榧?xì)粒棘球絳蟲(chóng)G1基因型最適宜的中間宿主，而且隨著近年來(lái)上述地區(qū)牛羊科學(xué)飼養(yǎng)的推廣，驅(qū)蟲(chóng)防疫規(guī)范，牛羊體質(zhì)增強(qiáng)，破壞了免疫逃避，免疫細(xì)胞容易侵入包囊，使其感染發(fā)育不久便開(kāi)始鈣化。

本試驗(yàn)中，cox1基因序列變異率高于nad1基因，且所有樣本均鑒定為G1基因型。G1基因型可根據(jù)cox1基因和nad1基因核苷酸序列變異分為不同單倍型[7]。cox1基因共有25個(gè)單倍型，Hap1是最常見(jiàn)的單倍型，核苷酸序列與先前報(bào)道的澳大利亞[8]、土耳其[9]、墨西哥、阿根廷、伊朗[10]等很多國(guó)家單倍型核苷酸序列相同，這表明此單倍型分布廣泛。Hap2與西班牙報(bào)道的序列相同[11]，Hap9和Hap19與意大利和巴西報(bào)道的序列相同[10]，其他單倍型目前尚未見(jiàn)到報(bào)道。Hap2、Hap3、Hap7僅發(fā)現(xiàn)于阿勒泰，Hap13、Hap18、Hap23-Hap25僅發(fā)現(xiàn)于伊犁，其余的單倍型僅發(fā)現(xiàn)于昌吉。nad1基因共有8個(gè)單倍型，Hap1是最常見(jiàn)的單倍型，核苷酸序列與先前報(bào)道的阿爾及利亞、意大利、哈薩克斯坦等國(guó)家的相同[10]；Hap2、Hap4、Hap7 與在西藏報(bào)道的序列相同[12]；Hap3、Hap5、Hap6和Hap8的序列目前尚未見(jiàn)到報(bào)道；Hap3-Hap8僅發(fā)現(xiàn)于昌吉。這表明同一地區(qū)的蟲(chóng)株具有相似的遺傳背景，而不同地區(qū)之間的蟲(chóng)株遺傳背景差異比較大。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)同一宿主可感染不同的單倍型，究其原因可能是其感染了不同來(lái)源的蟲(chóng)體排出的蟲(chóng)卵，蟲(chóng)卵可能來(lái)自同一條犬感染的不同蟲(chóng)體，也可能是來(lái)自不同犬感染的不同蟲(chóng)體，這揭示了細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)在草原牧區(qū)生態(tài)環(huán)境下傳播的復(fù)雜性，有待進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

新疆牛羊主要流行G1基因型，除了G1基因型，2019年Guo等[13]利用cox1基因分析伊犁、塔城和烏魯木齊羊源樣本中還發(fā)現(xiàn)G3基因型。本調(diào)查在阿勒泰、昌吉和伊犁所采集的樣本進(jìn)行cox1和nad1基因序列分析，均鑒定為G1基因型，未發(fā)現(xiàn)G3基因型，但cox1基因多態(tài)性比Guo等鑒定15個(gè)單倍型的較豐富。結(jié)果顯示：北疆部分地區(qū)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)G1基因型基因多態(tài)性較豐富，說(shuō)明細(xì)粒棘球蚴有廣泛中間宿主適應(yīng)性，在長(zhǎng)期進(jìn)化演變過(guò)程中，寄生蟲(chóng)在與宿主之間互相適應(yīng)中發(fā)生變異，并且在驅(qū)蟲(chóng)藥及免疫預(yù)防的選擇壓力作用下，促使它們發(fā)生變異，其變異累積的進(jìn)化可能導(dǎo)致出現(xiàn)抗原變異，進(jìn)而影響對(duì)家畜包蟲(chóng)病驅(qū)蟲(chóng)效果、診斷檢測(cè)和免疫預(yù)防[14]。

4 結(jié)論

該調(diào)查中，北疆阿勒泰、昌吉和伊犁等三個(gè)地區(qū)所鑒定的牛羊細(xì)粒棘球蚴均為G1基因型，并且感染率比之前文獻(xiàn)報(bào)道的有所下降。通過(guò)包囊樣本cox1基因和nad1基因序列進(jìn)行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)同一宿主可感染不同的蟲(chóng)卵。