陳玉昌，吳秋菊

1.長武縣人民醫(yī)院內(nèi)科，陜西 咸陽 713600；2.渭南市第二醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 渭南 714000

結(jié)腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，在男性和中老年人群中發(fā)病率較高，病死率極高。近年來，由于人們飲食結(jié)構(gòu)改變、吸煙酗酒等不良習(xí)慣增加，結(jié)腸癌發(fā)病處于上升趨勢。若結(jié)腸癌不能得到有效診斷和治療，將嚴(yán)重威脅人類生命健康[1]。研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(MicroRNA，miRNA)-592 在肝癌細(xì)胞中下調(diào)，與肝癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤侵襲及生存率降低等相關(guān)[2]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中miR-592也被證實(shí)低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)能顯著抑制該腫瘤細(xì)胞生長，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[3]。Sry相關(guān)組蛋白9 (Sry related HMG box 9，SOX9)是一種與細(xì)胞增殖、分化密切相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子。近年研究發(fā)現(xiàn)，SOX9 蛋白高表達(dá)與肝癌患者不良預(yù)后有關(guān)[4]。SOX9表達(dá)上調(diào)可通過調(diào)控表皮生長因子受體家族基因ERBB 表達(dá)促進(jìn)胰腺癌進(jìn)展[5]。然而miR-592 和SOX9 與結(jié)腸癌的關(guān)系未見研究。本研究通過檢測miR-592、SOX9 在結(jié)腸癌組織中表達(dá)情況，分析其與患者臨床病理特征及預(yù)后關(guān)系，探討其在結(jié)腸癌進(jìn)展中意義及對(duì)預(yù)后評(píng)估價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010 年2 月至2016 年2 月在長武縣人民醫(yī)院治療的106例結(jié)腸癌患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床病理檢查確診為結(jié)腸癌；②術(shù)前未進(jìn)行放、化療者；③臨床及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并患有其他部位腫瘤者；②心、腎、肝臟等功能嚴(yán)重不足者；③患有嚴(yán)重精神疾病者。106 例患者中男性62例，女性44例；年齡31～73歲，平均(58.35±18.39)歲；根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會(huì)TNM分期(第八版)[6]中的標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期23例，Ⅱ期36例，Ⅲ期47例；按腫瘤部位分類：左半結(jié)腸52 例，右半結(jié)腸54 例；按分化程度分類：高分化32例、中分化44例、低分化30例；按浸潤程度分類：T1～T250 例，T3～T456 例。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器和試劑 熒光定量PCR 儀(型號(hào)：Mx3005P，美國Stratagene 公司)，光學(xué)顯微鏡(型號(hào)：DM500，德國徠卡公司)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：RR047a，日本TaKaRa公司)，實(shí)時(shí)熒光定量(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)試劑盒(貨號(hào)：DRR041A，日本TaKaRa公司)，免疫組織化學(xué)染色試劑盒(貨號(hào)：8841-6599-45，美國Invitrogen 公司)，兔抗人SOX9 多克隆抗體(貨號(hào)：PA5-86301，美國Invitrogen公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣本采集 收集入組結(jié)腸癌患者經(jīng)手術(shù)切除的癌組織及癌旁正常組織(距腫瘤部位＞5 cm)。一部分放入液氮中迅速冷卻之后，研磨并用Trizol 法提取RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后將所得cDNA 于-80℃冰箱保存，用于qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。另一部分用10%福爾馬林溶液中固定后，制成4 μm厚石蠟切片用于免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 qRT-PCR檢測miR-592及SOX9 mRNA表達(dá)水平 使用qRT-PCR試劑盒配制實(shí)驗(yàn)所用反應(yīng)體系，20 μL 反應(yīng)體系如下：50×ROX Reference Dye 0.4 μL，2×SYBR?Premix Ex TaqTM10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μ L，cDNA 2 μ L，DEPC 處理水6.8 μ L。qRT-PCR 反應(yīng)程序如下：第一步95℃，30 s。第二步95℃，10 s；61℃，33 s；40℃，1 min，第二步40 個(gè)循環(huán)。一個(gè)樣品三個(gè)重復(fù)，使用2-△△CT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。本次qRT-PCR所用引物如表1所示，miR-592以U6為內(nèi)參基因，SOX9以GAPDH為內(nèi)參基因。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色 (1)染色方法：SOX9抗體稀釋比為1：100，按照免疫組化染色試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。切片經(jīng)二甲苯、酒精脫蠟、脫水后后用H2O2溶液浸泡15 min。在檸檬酸鹽緩沖液中加熱10 min。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗切片3次。甩干后滴加0.25%牛血清蛋白，室溫孵育40 min。加SOX9 抗體，4℃孵育14 h。復(fù)溫90 min、PBS 清洗后加生物素標(biāo)記的二抗39℃下孵育25 min，取出后用PBS 清洗3 次，每次5 min。用DAB 顯色劑顯色，10 min 后蘇木素復(fù)染1 min，沖洗、脫水后二甲苯固定，風(fēng)干后封片。顯微鏡下觀察，并采集圖像資料，400倍鏡下選擇5個(gè)視野記錄陽性細(xì)胞數(shù)。(2)染色結(jié)果判定：細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞。分別根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例記分。①染色強(qiáng)度：無色記0分，淡黃色記1分，棕黃色記2 分，棕褐色記3 分。②陽性細(xì)胞比例：＜5%記0分，5%～25%記1 分，26%～50%記2 分，51%～75%記3分，＞75%記4分。兩種記分相乘，0 分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8 分為陽性(++)，9～12 分為強(qiáng)陽性(+++)，其中陰性(-)、弱陽性(+)定義為高表達(dá)，陽性(++)、強(qiáng)陽性(+++)為低表達(dá)。

1.4 隨訪 入組患者經(jīng)治療出院后，以電話或復(fù)查方式對(duì)其進(jìn)行3 年隨訪，每3 個(gè)月1 次，隨訪期間觀察并記錄患者生存情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0 軟件對(duì)本研究中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間兩兩比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson 法進(jìn)行相關(guān)性分析；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)；用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行危險(xiǎn)因素分析。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織和癌旁組織的miR-592、SOX9 mRNA 表達(dá)水平比較 結(jié)腸癌組織中的miR-592 表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，SOX9 mRNA 水平顯著高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

2.2 結(jié)腸癌組織和癌旁組織的SOX9 蛋白表達(dá)水平比較 SOX9 蛋白主要在細(xì)胞核中表達(dá)，結(jié)腸癌組織中SOX9 蛋白陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=51.080，P＜0.05)，見表3和圖1。

images/BZ_20_1272_781_2269_814.png組別結(jié)腸癌組織癌旁組織例數(shù)106 106-38 89+30 12images/BZ_20_1875_845_1913_988.png+++12 0陽性率(%)64.15 16.03

表2 結(jié)腸癌組織和癌旁組織的miR-592、SOX9 mRNA 表達(dá)水平比較(±s)

表2 結(jié)腸癌組織和癌旁組織的miR-592、SOX9 mRNA 表達(dá)水平比較(±s)

組別結(jié)腸癌組織癌旁組織t值P值例數(shù)106 106 miR-592/U6 0.56±0.16 0.99±0.30 13.021＜0.05 SOX9/GAPDH 2.38±0.74 1.01±0.32 17.495＜0.05

圖1 結(jié)腸癌組織中SOX9蛋白表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×400)

2.3 結(jié)腸癌組織中miR-592、SOX9 表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 將入組患者以結(jié)腸癌組織中miR-592 表達(dá)水平平均數(shù)(0.59)和SOX9 蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。結(jié)腸癌組織中miR-592、SOX9 表達(dá)水平與性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位無關(guān)(P＞0.05)，與分化程度、浸潤程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)，見表4。

表4 miR-592、SOX9表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

2.4 結(jié)腸癌組織中miR-592、SOX9 mRNA表達(dá)相關(guān)性 如圖2 所示，結(jié)腸癌組織中miR-592 與SOX9 mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.562，P＜0.05)。

圖2 結(jié)腸癌組織中miR-592與SOX9相關(guān)性分析

2.5 miR-592和SOX9表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后相關(guān)性 通過Kaplan-Meier 生存分析可知，miR-592 低表達(dá)組患者3 年生存13 例，死亡46 例；miR-592 高表達(dá)組患者3年生存32例，死亡15例。miR-592低表達(dá)組患者3年總生存率為22.03%，明顯低于高表達(dá)組患者的68.08%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

SOX9 高表達(dá)組患者3 年生存16 例，死亡52 例；SOX9 低表達(dá)組患者3 年生存29 例，死亡9 例。SOX9 高表達(dá)組患者3 年總生存率為42.11%，明顯低于低表達(dá)組患者的76.32%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3。

圖3 Kaplan-Meier生存分析

2.6 結(jié)腸癌患者預(yù)后影響因素 Cox 回歸模型單因素分析結(jié)果顯示，性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位與結(jié)腸癌患者預(yù)后無關(guān)(P＞0.05)；右半結(jié)腸、低分化、T3-T4浸潤、TNM分期Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-592低表達(dá)、SOX9 高表達(dá)是影響結(jié)腸癌患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P＜0.05)。多因素分析結(jié)果顯示，TNM 分期Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-592 低表達(dá)、SOX9 高表達(dá)是影響結(jié)腸癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P＜0.05)，見表5。

表5 結(jié)腸癌患者預(yù)后的影響因素

3 討論

結(jié)腸癌患者在患病初期不易被確診，多數(shù)患者入院治療時(shí)腫瘤已進(jìn)展至中晚期[7]，臨床探究與結(jié)腸癌相關(guān)的早期診斷標(biāo)志物及結(jié)腸癌預(yù)后影響因子，對(duì)提高結(jié)腸癌診斷效果、改善患者預(yù)后有一定意義。miRNA是一類具有調(diào)控功能的短鏈RNA，在腫瘤進(jìn)展中有調(diào)控作用。研究表明，miR-126在結(jié)腸癌組織中低表達(dá)，可作為結(jié)腸癌潛在診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[8]，miR-375在結(jié)腸癌中也被證實(shí)顯著下調(diào)，可靶向抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]，表明多種miRNA與結(jié)腸癌進(jìn)展有關(guān)，可能影響結(jié)腸癌患者預(yù)后。

miR-592屬于miRNA家族，據(jù)報(bào)道m(xù)iR-592在乳腺癌組織中明顯下調(diào)，體外過表達(dá)miR-592可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[10]。LI等[11]發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌組織中miR-592表達(dá)下調(diào)，可能作為生物標(biāo)志物診斷預(yù)測非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展[11]。本研究結(jié)果表明，結(jié)腸癌組織中miR-592 表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與前人在乳腺癌[10]和非小細(xì)胞肺癌[11]中研究結(jié)果一致，提示miR-592 可能與結(jié)腸癌發(fā)生有關(guān)[10，12]。JIA 等[12]研究報(bào)道，miR-592 在肝癌細(xì)胞中低表達(dá)，與腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-592表達(dá)水平變化與結(jié)腸癌分化程度、浸潤程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-592 低表達(dá)可能通過影響結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲等促進(jìn)腫瘤分化程度降低、TNM 分期升高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，參與結(jié)腸癌進(jìn)展。

SOX9作為SOX家族轉(zhuǎn)錄因子一員，具有SOX家族共性，與人類生長發(fā)育多種生物過程有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，敲除SOX9 可顯著抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖和侵襲[13]。SOX9 被發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)上調(diào)，與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)[14]。另有研究報(bào)道，SOX9高表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者低生存率有關(guān)[15]。本研究中，SOX9 mRNA在結(jié)腸癌組織中表達(dá)水平顯著上調(diào)，且SOX9蛋白在結(jié)腸癌組織中陽性表達(dá)率顯著高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，SOX9 蛋白表達(dá)水平與分化程度、浸潤程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與前人在甲狀腺腫瘤[13]和胃癌[15]中研究結(jié)果一致，提示SOX9 表達(dá)上調(diào)可能通過調(diào)控癌細(xì)胞增殖和遷移，影響腫瘤低分化、TNM分期升高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展。

另本研究結(jié)果顯示，miR-592 低表達(dá)、SOX9 高表達(dá)組患者3 年總生存率分別顯著低于miR-592 高表達(dá)、SOX9低表達(dá)組患者，提示miR-592低表達(dá)、SOX9高表達(dá)可能預(yù)示結(jié)腸癌患者生存率低等不良預(yù)后。且低分化、T3-T4浸潤、TNM 分期Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-592 低表達(dá)、SOX9 高表達(dá)是影響結(jié)腸癌患者不良預(yù)后危險(xiǎn)因素，進(jìn)一步提示miR-592、SOX9 可作為評(píng)估結(jié)腸癌患者不良預(yù)后的生物標(biāo)志物。LI 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-592 可能通過抑制SOX9 蛋白活性在非小細(xì)胞肺癌中作為抑癌因子發(fā)揮作用。本研究經(jīng)Targetscan 網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)，SOX9 是miR-592 的靶基因，且結(jié)腸癌組織中miR-592 與SOX9 mRNA 水平呈負(fù)相關(guān)，提示miR-592和SOX9可能相互作用，共同參與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展，與LI等[11]在非小細(xì)胞肺癌研究中結(jié)果相似，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，結(jié)腸癌組織中miR-592 表達(dá)下調(diào)、SOX9 表達(dá)上調(diào)，與腫瘤部位、分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者生存率低等有關(guān)，兩者之間可能存在作用機(jī)制共同參與結(jié)腸癌進(jìn)展，對(duì)結(jié)腸癌預(yù)后評(píng)估有一定意義。但本研究未能深入研究miR-592 與SOX9 相互作用機(jī)制，將在下一步研究中進(jìn)行驗(yàn)證和探究。