江蘭，張衍國，王小霞，王歡，劉濤

空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院皮膚科，陜西 西安 710038

增生性瘢痕是炎性反應(yīng)及創(chuàng)傷后膠原纖維細(xì)胞的增殖失控、細(xì)胞外基質(zhì)過度生成并無序沉積的病理性瘢痕，屬于纖維增生性疾病[1]。增生性瘢痕會(huì)引發(fā)疼痛、瘙癢、功能障礙等并發(fā)癥，嚴(yán)重降低患者生活質(zhì)量[2]?，F(xiàn)階段增生性瘢痕的發(fā)病機(jī)制仍處于研究中。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長及分化，對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)形成、創(chuàng)傷愈合、免疫功能調(diào)節(jié)等過程均有影響作用[3]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K)與蛋白激酶B (protein kinases B，PKB)組成的PI3K/PKB 信號(hào)通路在增生性瘢痕的形成中發(fā)揮著重要的作用[4]。因此，本研究探討增生性瘢痕組織中TGF-β1、PI3K表達(dá)水平及其臨床意義，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院2017 年4 月至2019 年5 月40 例確診為增生性瘢痕患者的增生性瘢痕組織(增生性瘢痕組)，同時(shí)選取20 例其他手術(shù)患者切除的正常皮膚組織(正常皮膚組)，所有檢測均獲得受試者知情同意，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查確診為增生性瘢痕；②首次接受增生性瘢痕治療；③近期未服用抑制瘢痕增生的藥物；④瘢痕未出現(xiàn)破潰、感染。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并免疫、皮膚、傳染性疾?。虎诤喜⑷焉锲?、其他結(jié)締組織疾病者；③臨床資料不全者。兩組患者的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)等資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性，見表1。

表1 兩組患者的一般資料比較(x-±s)

1.2 試劑與儀器 鼠抗人TGF-β1單克隆抗體、兔抗人PI3K多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；免疫組化SP試劑盒、DAB顯色劑(北京中山金橋有限技術(shù)公司)；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒(美國GeneCopocia 公司)；TGF-β1、PI3K、GAPDH引物(上海吉瑪生物公司)；PCR儀(生產(chǎn)公司：美國ABI公司，型號(hào)：ABI 7900)。

1.3 檢測方法

1.3.1 石蠟切片免疫組織化學(xué)法(SP法) 增生性瘢痕組患者接受手術(shù)治療，術(shù)后取增生性瘢痕組織及其他手術(shù)患者切除的正常皮膚組織，將其分別置于10%甲醇中，固定12 h后，使用石蠟包埋制成切片，常規(guī)組織切片脫蠟至水，將檸檬酸緩沖液加熱至98℃進(jìn)行熱抗原修復(fù)，使用37℃3%H2O2去離子水孵育5 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，分別使用鼠抗人TGF-β1單克隆抗體、兔抗人PI3K 多克隆抗體，室溫孵育1 h，加入IgG 抗體-HRP 多聚體，室溫孵育10 min，使用DAB 顯色10 min，每個(gè)步驟間使用緩沖液洗3 次。蘇木素復(fù)染后，使用乙酸乙醇進(jìn)行分化。陰性對(duì)照使用PBS 緩沖液代替。通過光學(xué)顯微鏡觀察免疫組化結(jié)果，TGF-β1、PI3K 陽性判定標(biāo)準(zhǔn)參考Shimizu 法[5]，按照切片陽性細(xì)胞的著色強(qiáng)度分為無著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色4 個(gè)等級(jí)，分別計(jì)分0、1、2、3 分；按照陽性著色面積分為按無著色、著色面積＜1/3、1/3≤著色面積＜2/3，著色面積≥著色面積4個(gè)等級(jí)，分別計(jì)分0、1、2、3分。評(píng)分之和＜3分，即為陰性；評(píng)分之和≥3分，即為陽性。

1.3.2 RT-PCR檢測 使用PCR儀，反應(yīng)體系20 μL：7.1 μL ddH2O，0.4 μL ROX 燃料，2 μL cDNA，10 μL SYBR 熒光燃料，上下游引物各0.25 μL，引物序列見表2。反應(yīng)條件：預(yù)變性溫度為95℃，時(shí)間30 s，變性溫度95℃，時(shí)間5 s，退火溫度59℃，時(shí)間30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參照，結(jié)果使用△循環(huán)閾值(Ct)法處理，△Ct=目的基因Ct值-內(nèi)參Ct值，TGF-β1、PI3K表達(dá)水平使用2-△△Ct表示。

1.4 觀察指標(biāo) (1)比較增生性瘢痕組和正常皮膚組組織中TGF-β1、PI3K表達(dá)情況及表達(dá)水平。(2)增生性瘢痕組術(shù)后隨訪6 個(gè)月，按照復(fù)發(fā)與否分為復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組，比較復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組組織中TGF-β1、PI3K表達(dá)水平。(3)分析增生性瘢痕組織中TGF-β1與PI3K表達(dá)的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料服從正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；兩個(gè)因素間相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)性分析；以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 增生性瘢痕組和正常皮膚組的TGF-β1、PI3K表達(dá)情況比較 增生性瘢痕組組織中的TGF-β1、PI3K陽性表達(dá)率分別為85.0%、80.0%，明顯高于正常皮膚組的15.0%、25.0%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

2.2 增生性瘢痕組和正常皮膚組的TGF-β1、PI3K表達(dá)水平比較 增生性瘢痕組組織中的TGF-β1、PI3K表達(dá)水平明顯高于正常皮膚組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表4。

表3 兩組組織中的TGF-β1、PI3K表達(dá)情況比較[例(%)]

表4 兩組組織中的TGF-β1、PI3K表達(dá)水平比較(x-±s)

2.3 增生性瘢痕術(shù)后未復(fù)發(fā)組和復(fù)發(fā)組TGF-β1、PI3K表達(dá)水平比較 增生性瘢痕組術(shù)后隨訪6個(gè)月，術(shù)后復(fù)發(fā)組的TGF-β1、PI3K表達(dá)水平高于未復(fù)發(fā)組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表5。

表5 未復(fù)發(fā)組和復(fù)發(fā)組的TGF-β1、PI3K表達(dá)水平比較(x-±s)

2.4 增生性瘢痕組織中TGF-β1與PI3K表達(dá)的相關(guān)性 經(jīng)Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，增生性瘢痕組織中TGF-β1表達(dá)水平與PI3K表達(dá)水平呈明顯的正相關(guān)(r=0.745，P＜0.05)。

3 討論

增生性瘢痕是不具有正常皮膚功能及結(jié)構(gòu)的病理性瘢痕，與細(xì)胞外基質(zhì)和成纖維細(xì)胞的功能異常密切相關(guān)[6-7]。外科手術(shù)、燒傷、創(chuàng)傷后均可能出現(xiàn)不同程度的增生性瘢痕，常見于四肢、肩部、背部、頜面部、頭頸處，對(duì)患者的外觀造成影響。

增生性瘢痕的主要病理特征為成纖維蛋白增殖過度、細(xì)胞外基質(zhì)沉積失控，最終引發(fā)創(chuàng)口愈合過度。TGF-β1是具有較強(qiáng)促纖維化作用的細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子，參與創(chuàng)口愈合過程，對(duì)炎癥因子分泌、成纖維蛋白增殖及凋亡、膠原分解及合成、細(xì)胞外基質(zhì)重建等過程均會(huì)產(chǎn)生影響[8-9]。LI等[10]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1對(duì)上皮細(xì)胞的增殖及分化有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，有利于產(chǎn)生纖維連接蛋白。TGF-β1是促細(xì)胞分裂劑，其表達(dá)水平與成纖維細(xì)胞增殖水平呈正相關(guān)，與成纖維細(xì)胞凋亡水平呈負(fù)相關(guān)。據(jù)SERBAN等[12]研究，TGF-β1通過調(diào)控細(xì)胞周期影響成纖維細(xì)胞的表達(dá)。TGF-β1能夠調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞凋亡-增殖平衡，在創(chuàng)口修復(fù)過程中，創(chuàng)口處豐富的TGF-β1會(huì)打破平衡，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞增殖過度，形成增生性瘢痕[11]。本研究中增生性瘢痕組中的TGF-β1陽性表達(dá)率、表達(dá)水平均高于正常皮膚組，提示TGF-β1參與了增生性瘢痕的形成，增生性瘢痕的形成可能與TGF-β1在創(chuàng)口愈合過程中表達(dá)水平過高有關(guān)。在增生性瘢痕中，基質(zhì)黏多糖蛋白、膠原經(jīng)TGF-β1刺激后產(chǎn)生大量蛋白多糖、彈性蛋白、纖維連接蛋白、Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致膠原纖維出現(xiàn)纖維化。TGF-β1會(huì)抑制膠原蛋白的降解及膠原酶的產(chǎn)生，是細(xì)胞外基質(zhì)沉積失控的調(diào)控因子，與細(xì)胞外基質(zhì)沉積呈正相關(guān)，有利于創(chuàng)口愈合，形成增生性瘢痕。ZHOU等[13]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在創(chuàng)口愈合的早期能夠傳遞信號(hào)物質(zhì)避免愈合過度，但TGF-β1表達(dá)過高時(shí)信號(hào)物質(zhì)可能導(dǎo)致增生性瘢痕形成。

PI3K 是一種異源二聚體，由調(diào)節(jié)亞基p85 和催化亞基p110 組成，活性與蛋白激酶、脂類激酶類似[14]。激活PI3K的方式有兩種，一是催化亞基p110和Ras蛋白直接結(jié)合活化PI3K，二是通過和IGF、PDGF等生長因子受體相互作用，改變異源二聚體的構(gòu)象，最終被激活。活化后的PI3K發(fā)生磷酸化，生成PIP2和PIP3，在兩者作用下，下游的蛋白激酶(如：PKA、PKB、PKC)被激活，進(jìn)而激活PI3K/PKB 通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移、轉(zhuǎn)運(yùn)及凋亡。本研究中增生性瘢痕組中的PI3K陽性表達(dá)率、表達(dá)水平均高于正常皮膚組，表明增生性瘢痕的形成與PI3K 有關(guān)，這可能是因?yàn)镻I3K 通過控制PI3K/PKB 通路改變成纖維細(xì)胞的增殖與凋亡。PI3K/PKB 通路下游存在mTOR 基因，當(dāng)PI3K/PKB 通路被激活后會(huì)使mTOR發(fā)生磷酸化[15]。在創(chuàng)口愈合過程中，PI3K/PKB/mTOR 通路可以調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)，控制蛋白質(zhì)的合成，最終調(diào)控細(xì)胞的增殖及生長。此外，整合素連接激酶的PH 結(jié)構(gòu)域也可以與PI3K 相結(jié)合，整合素連接激酶被激活后會(huì)對(duì)PKB的Ser473進(jìn)行磷酸化，通過PI3K/整合素連接激酶/PKB 信號(hào)通路調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的分化及生長。本研究還發(fā)現(xiàn)，增生性瘢痕術(shù)后復(fù)發(fā)組的TGF-β1、PI3K 表達(dá)水平明顯高于未復(fù)發(fā)組，Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示在增生性瘢痕中TGF-β1、PI3K表達(dá)呈正相關(guān)，表明兩者在增生性瘢痕的形成中發(fā)揮著重要作用，并能夠提示增生性瘢痕患者術(shù)后復(fù)發(fā)情況。

綜上所述，在增生性瘢痕組織中TGF-β1、PI3K 均存在高表達(dá)，兩者呈正相關(guān)，對(duì)增生性瘢痕術(shù)后復(fù)發(fā)有提示作用。