苑婕，王珍珍，宋麗娟，薛媛，張維金

1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八八醫(yī)院第三派駐門診部，河南 鄭州 450001；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453000

延胡索為罌粟科(Papaveraceae)植物延胡索(Corydalis yanhusuoW.T.Wang)的干燥塊莖，又名元胡、玄胡等，始載于漢代《神農(nóng)本草經(jīng)》，性味溫、辛、苦，歸心、肝、脾經(jīng)等[1]?！靶耐从?，速覓延胡”出自《雷公炮炙論》，《本草綱目》也記載：“活血利氣，止痛，通小便”[2]，說明從漢代開始延胡索已經(jīng)被用于治療各種疾病，至今已有幾千年歷史。近現(xiàn)代延胡索的鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、擴張冠狀血管、改善心肌缺血、抗腫瘤、治療胃潰瘍等藥理作用已得到廣泛研究，但其物質(zhì)基礎與作用機制尚待更深入系統(tǒng)的挖掘。

網(wǎng)絡藥理學是基于系統(tǒng)生物學、高通量組學、計算機模擬計算及醫(yī)藥大數(shù)據(jù)等多學科理論技術(shù)的強大支撐才得以快速開展應用的，其將生物網(wǎng)絡與藥物作用網(wǎng)絡融合一體，從網(wǎng)絡平衡的整體性出發(fā)進行網(wǎng)絡分析，探索藥物和機體的復雜相互作用[3]。中醫(yī)藥整體觀、辨證論治的特點、組方配伍的原則，與網(wǎng)絡藥理學的整體性和系統(tǒng)性不謀而合。應用網(wǎng)絡藥理學進行中醫(yī)藥研究不僅能篩選中藥有效成分、闡釋中藥整體作用機制，而且能探究中藥復方配伍規(guī)律，為中醫(yī)藥理論傳承、中藥新藥創(chuàng)制提供科學依據(jù)[4]。本文以延胡索為研究對象，利用有監(jiān)督預測分類方法中的隨機森林算法[5]構(gòu)建延胡索“藥物成分-靶標-心腦血管相關(guān)疾病”復雜網(wǎng)絡，觀察延胡索藥物作用網(wǎng)絡在整體生物網(wǎng)絡上的投射，對關(guān)鍵節(jié)點進行網(wǎng)絡分析，預測并印證延胡索治療心腦血管類疾病的有效成分及潛在靶點，為指導臨床應用及開發(fā)更多候選藥物提供參考和思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集 陽性樣本集是從KEGG數(shù)據(jù)庫[6]直接下載的小分子化學藥及其相應靶蛋白受體的分子結(jié)構(gòu)信息，包括四類藥物-靶點配對數(shù)據(jù)，如圖1；陰性樣本集[7]獲得如圖2。

圖1 KEGG數(shù)據(jù)庫下載的陽性樣本集

圖2 陰性樣本集

1.2 分子描述符 計算藥物和靶蛋白的分子描述符分別應用PowerMV (www.niss.org/PowerMV)和ProFeat (http://bidd2.nus.edu.sg/cgi-bin/profeat2016/main.cgi)，共獲得7 202 維的配對數(shù)據(jù)[7]。穩(wěn)定的模型需要具備一定的模型精度和模型運行速度，因此本文采用主成分分析法保留原始數(shù)據(jù)99.7%的信息量進行降維處理。將本文四組陰、陽數(shù)據(jù)集分別對應合并組成四組訓練集，降維后四組矩陣為8 133×17、4 095×4、1 860×24、258×17；進行算法學習前，再按如下公式進行歸一化處理：x(i)=[x0(i)-Min(x0)]/[Max(x0)-Min(x0)](式1)。其中x0(i)是原始數(shù)據(jù)；x(i)是歸一化后數(shù)據(jù)，其值為-1～1。

1.3 方法 隨機森林算法(random forest，RF)最早是由BREIMAN[8]提出并應用于高維數(shù)據(jù)處理的一類有監(jiān)督學習分類器，運用一組分類回歸樹(Classification and Regression Tree，CART)進行預測，結(jié)合了決策樹分類模型、Bootstrap aggregating (Bagging)模型組合方法和特征隨機選取思想等，具有分類精度高、泛化能力強等優(yōu)點。隨機森林模型建立步驟[9]如圖3。本文采用K折交叉驗證(K-fold cross-validation)檢驗RF的分類能力和預測精度。假設可選的模型為S={S1,S2,S3,…Sd}，本研究采用10折交叉驗證(K=10)，將訓練集的1/10作為測試集，每個模型訓練10次，測試10次，錯誤率為10次的平均，最終選擇平均率最小的模型Si。

圖3 構(gòu)建隨機森林模型

2 結(jié)果

2.1 模型優(yōu)化 在隨機森林算法構(gòu)建過程中，決策樹的個數(shù)(rtree)和節(jié)點分裂過程中抽取的特征個數(shù)(f)是需要優(yōu)化的兩個關(guān)鍵參數(shù)。本文采用網(wǎng)格搜索法對rtree 和f 兩參數(shù)進行優(yōu)化，以獲得最高的模型交叉驗證正確率(Ac)，結(jié)果見表1。Ac=(1-WY/Y)×100%(式2)。其中WY 是分類錯誤的樣本個數(shù)，Y 則是所有樣本個數(shù)。

表1 本文模型的參數(shù)優(yōu)化

2.2 延胡索作用靶點預測 已報道的延胡索化學成分從化學專業(yè)數(shù)據(jù)(http://www.organchem.csdb.cn/scdb/)下載，共計20個。將上述20個化合物與四種已知的靶點進行組合并構(gòu)建預測集，投入RF 建立的分類預測模型前，先按訓練集數(shù)據(jù)處理方法對預測集計算分子描述符、降維和歸一化等處理。表2 列出了與延胡索化學成分作用頻次較高且有代表性的15 個靶點；應用Cytoscape_v3.7.2 軟件構(gòu)建延胡索成分-靶點-疾病網(wǎng)絡[10]，見圖4；延胡索中5 號化合物(延胡索乙素)-靶點-疾病網(wǎng)絡模型，見圖5。兩個網(wǎng)絡中三角形、橢圓形、長方形節(jié)點分別代表延胡索化學成分、潛在靶點、相關(guān)疾病；某化合物與潛在作用靶點、靶點與相關(guān)疾病，以邊相連。從圖4可見，延胡索化學成分與靶點間存在復雜的網(wǎng)絡關(guān)系；表3 中連接度是指藥物成分節(jié)點與靶點節(jié)點所形成的連接邊數(shù)總和，即表3列出了延胡索20 個成分在該網(wǎng)絡模型中潛在作用靶點數(shù)目，每個化合物的平均靶點數(shù)為9.8；由于本文篇幅所限，在此僅以一個化學成分的網(wǎng)絡可視圖舉例說明，從圖5 可見，5 號成分(延胡索乙素)作用于體內(nèi)11個靶點，此11 個靶點與圖中44 種疾病相關(guān)聯(lián)。以上網(wǎng)絡分析反應了中藥與疾病間“多成分-多靶點-多途徑”的作用特點。

圖4 延胡索20個成分-靶點-疾病網(wǎng)絡模型

images/BZ_15_207_242_2274_275.png序號1 2 3 4 5 6 7 8 9靶點名稱α-2A 腎上腺素受體(alpha-2A adrenergic receptorα-2A)α-2C 腎上腺素受體(alpha-2C adrenergic receptorα-2C)名稱縮寫ADRA2A頻次20類別G蛋白ADRA2C 19 G蛋白γ-氨基丁酸受體亞單位α-5 (gamma-amino butyricacid receptor subunit alpha-5)β-2腎上腺素受體(beta-2 adrenergic receptor)α-1D 腎上腺素能受體(alpha-1D adrenergic receptor)GABRA5 17離子通道心腦血管相關(guān)疾病心律失常(heart arrhythmia)、肥胖(obesity)、疼痛(pain)、老年癡呆癥(dementia)高血壓(hypertension)、低血壓(hypotension)、心律失常(heart arrhythmia)、心力衰竭(heart failure)、老年癡呆癥(dementia)、肥胖(obesity)、糖尿病(diabetes)、哮喘(asthma)、疼痛(pain)、阿爾茨海默病(alzheimer disease)、糖尿病腎病(diabetic nephropathy)、消化性潰瘍(peptic ulcer)阿爾茨海默病(Alzheimer disease)ADRB2 17 G蛋白ADRA1D 14 G蛋白β-1腎上腺素受體(beta-1 adrenergic receptor)ADRB1 8 G蛋白α-1a腎上腺素能受體(alpha-1A adrenergic receptor)α-2B 腎上腺素能受體(alpha-2B adrenergic receptor)多巴胺d2受體[D(2)dopamine receptor]ADRA1A G蛋白ADRA2B G蛋白心動過緩(bradycardia)、心肌梗死(heart block)、哮喘(asthma)、肥胖(obesity)、高血壓(hypertension)充血性心力衰竭(congestive heart failure)、高血壓(hypertension)、心率失常(heart arrhythmia)、糖尿病(diabetes)、兒科癌癥(pediatric cancer)、疼痛(pain)急性室上性心動過速(acute supraventricular tachycardia)、心絞痛(angina pectoris)、冠狀動脈疾病(coronary artery disease)、心率失常(cardiac arrhythmias)、高血壓(hypertension)、心源性休克(cardiogenic shock)、心力衰竭(heart failure)、心室早搏(ventricular premature beats)、心室纖顫(ventricular fibrillation)、糖尿病(diabetes)、肥胖(obesity)、偏頭痛(migraine)高血壓(hypertension)、心律失常(heart arrhythmia)、前列腺癌(prostate cancer)、疼痛(pain)心律失常(heart arrhythmia)、高血壓(hypertension)、疼痛(pain)DRD2 7 5 4 G蛋白10 CACNA1B 離子通道11 GABRG2離子通道阿爾茨海默病(Alzheimer disease)、乳腺癌(breast cancer)、哮喘(asthma)、心力衰竭(cardiac failure)、強心劑(cardiotonic)、腦血管缺血(cerebrovascular ischaemia)、低血壓(hypotension)、高血壓(hypertension)、心力衰竭(heart failure)、惡性原發(fā)性高血壓(malignant essential hypertension)、偏頭痛(migraine)、疼痛(pain)、維持血壓在低血壓狀態(tài)(maintain blood pressure in hypotensive states)、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer)、帕金森病(Parkinson's disease)、周圍血管收縮(peripheral vasoconstriction)、肺動脈高壓(pulmonary hypertension)、胃腸問題(gastrointestinal problems)、炎癥性疾病(inflammatory disease)高血壓(high blood pressure)、偏頭痛(migraine)、疼痛(pain)、再灌注損傷(reperfusion injury)、創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury)、心力衰竭(cardiac failure)癲癇發(fā)作(epileptic seizures)、炎癥(inflammation)12電壓依賴型N 型鈣通道α-1B 亞基(voltage-dependent N-type calcium channel subunit alpha-1B)γ-氨基丁酸受體亞單位γ-2 (gamma-aminobutyric acid receptor subunit gamma-2)鈉通道蛋白1-α亞基(sodium channel protein type 1 subunit alpha)SCN1A 2 2 2離子通道13 ADRA1B G蛋白心絞痛(angina pectoris)、心力衰竭(cardiac failure)、心血管疾病(cardiovascular disorder)、腦梗死(cerebral infarction)、心律失常(cardiac arrhythmias)、腦血管缺血(cerebrovascular ischaemia)、缺血(ischemia)、糖尿病(diabetes)、癲癇發(fā)作(epileptic seizures)、胃癌(gastric cancer)、心 律 失 常(heart arrhythmia)、偏 頭 痛(migraine)、疼痛(pain)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病(neurological disease)、帕金森病(Parkinson's disease)、1型糖尿病(type 1 diabetes)高血壓(hypertension)、疼痛(pain)、心律失常(heart arrhythmia)14 α-1b腎上腺素能受體(alpha-1B adrenergic receptor)5-羥色胺2a 受體(5-hydroxytryptamine receptor 2a)HTR2A G蛋白15過氧化物酶體增殖物激活受體γ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma)PPARG 2 2 1核蛋白高血壓(hypertension)、心血管疾病(cardiovascular disorder)、腦血管缺血(cerebrovascular ischaemia)、偏頭痛(migraine)、糖 尿病(diabetes)、帕金森病(Parkinson's disease)高脂血癥(hyperlipidaemia)、阿爾茨海默病(Alzheimer disease)、糖尿病(diabetes)、2 型糖尿病(type 2 diabetes)、1 型糖尿病(type 1 diabetes)

表3 20種化合物的連接度

2.3 文獻驗證 對上文預測與延胡索20 種成分相關(guān)的心腦血管疾病體內(nèi)潛在作用靶點進行文獻驗證。(1)鈉離子通道受體(SCN)、鈣離子通道受體(CACN)、γ-氨基丁酸受體(GABA)等是延胡索化學成分在體內(nèi)主要關(guān)聯(lián)的離子通道受體。姚偉星等[11]通過四氫巴馬汀(延胡索乙素)的衍生物7-氯芐基四氫巴馬汀對多種實驗性心律失常模型的研究發(fā)現(xiàn)，后者對Na+通道有阻滯作用，使跨膜動作電位及有效不應期延長是其抗心律失常的重要機制。汪大金等[12]從臨床電生理角度和臨床療效方面證實延胡索的生物堿-左旋四氫巴馬汀為較廣的抗心律失常譜的鈣拮抗劑。張萍等[13]對前人[14-15]的研究結(jié)果進行總結(jié)，得出延胡索堿可作用于鈣離子通道的結(jié)論，抗心律失常主要是抑制鈣電流，降低鈣超載。邢淑華等[16]研究發(fā)現(xiàn)左旋延胡索乙素通過阻滯α受體、降低外周兒茶酚胺含量改善冠脈血流并有利于實驗動物血壓降低[17]。(2)腎上腺素受體(ADR)、5 羥色胺受體(5-HT)、多巴胺受體(DA)等可能是G蛋白受體主要潛在作用靶標；過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)是網(wǎng)絡分析所得的核蛋白受體潛在的作用靶點。利用網(wǎng)絡藥理學技術(shù)，虞希沖等[18]預測出延胡索生物堿可調(diào)控21 種糖尿病及其并發(fā)癥的34 個靶點。原阿片堿-PPARG、小檗堿-AKT、巴馬汀-KCNJ11、四氫巴馬汀-NOS3等藥靶與延胡索抗非胰島素依賴型糖尿病和糖尿病(未分型)的作用有關(guān)；延胡索調(diào)控高血壓與冠心病則主要通過紫堇堿-ADRA1、四氫小檗堿-DRD1、海罌栗堿-SELE、四氫巴馬汀-NOS3等藥靶實現(xiàn)。韓彥琪等[19]通過受體實驗得出結(jié)果，延胡索可能是通過激動ADRB2、抑制M2 和TP 受體發(fā)揮活血、行氣、化瘀功效的。ADRB2 受體是與心血管、哮喘等疾病相關(guān)的重要靶標之一。原阿片堿和延胡索乙素是延胡索潛在重要的藥效物質(zhì)基礎，對D2 受體有拮抗作用。張鐵軍等[20]研究發(fā)現(xiàn)延胡索和白芷配伍后發(fā)揮多種生物活性、產(chǎn)生增效作用是通過激活5-HT1A、OPRM1、ADRB2 受體，抑制D2、M2 和TP 受體來調(diào)節(jié)下游生物通路實現(xiàn)的。胡江元[21]研究發(fā)現(xiàn)延胡索乙素能優(yōu)先阻滯位于腦區(qū)紋狀體等的D2 受體，進而加強腦干下行控制的痛覺調(diào)制系統(tǒng)的抗痛功能。

除心腦血管類疾病外，所得靶點與其他一些重要疾病也被預測出相關(guān)性并得到了文獻驗證。如LEUNG等[22]在進行高架十字迷宮模型研究時發(fā)現(xiàn)，延胡索的抗焦慮作用，至少部分與GABAA 受體有關(guān)。延胡索的抗實驗性胃潰瘍作用，推測機制：一是與其增加胃黏膜血流量有關(guān)；二是通過部分阻滯胃黏膜DA 受體實現(xiàn)[23]。徐靖宇等[24]將嗎啡依賴胃腸損傷大鼠作為實驗模型，研究延胡索和左旋延胡索乙素保護嗎啡依賴繼發(fā)胃腸損傷，結(jié)論是兩者能逆轉(zhuǎn)胃腸多巴胺和D2R的異常減少和增加。

3 討論

延胡索作為一味常用傳統(tǒng)中藥材，以活血化瘀、利氣止痛為主?，F(xiàn)代藥理實驗研究證明對心腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)等均有明確的藥理作用。從延胡索的研究現(xiàn)狀中可以看出，對叔胺堿類如延胡索乙素的研究較多，其主要起鎮(zhèn)痛作用；季胺堿類如紫堇堿等研究較少，可抗心肌缺血等，其作用機制鮮有報道。本文運用網(wǎng)絡藥理學的方法使延胡索20 種成分-靶點-疾病網(wǎng)絡可視化并對網(wǎng)絡進行拓撲研究，分析關(guān)鍵節(jié)點、預測潛在靶標、聯(lián)系相關(guān)疾病，并得到了較好的文獻驗證，為延胡索治療心腦血管等疾病的物質(zhì)基礎及分子作用機制提供了理論依據(jù)。本研究方法為虛擬篩選中藥藥效物質(zhì)成分及潛在作用靶點，及應用現(xiàn)代科學方法研究中藥作用機制提供一定的參考思路。