董珺， 曾波航， 田朝偉， 莫沛， 劉建衛(wèi)， 熊龍根， 黎佼△

廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 1腫瘤科， 2心內科(廣東廣州 510260)

我們前期的研究表明：通過年輕小鼠骨髓細胞重建年老小鼠骨髓，可再生心肌梗死后年老小鼠心臟功能。年輕骨髓細胞可以通過旁分泌等分子機制增加年老小鼠心肌梗死后細胞存活，促進細胞增殖以及血管再生[1]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Sca-1+骨髓干細胞在重建年老小鼠心臟中表達升高最明顯[2]。通過年輕Sca-1+骨髓干細胞重建年老小鼠骨髓，可通過旁分泌轉化生長因子-β1(TGF-β1)，促進心外膜細胞上皮間質轉化，最終改善心肌梗死后年老小鼠心臟功能[3-4]。最新的研究證實，衰老同樣影響了血管平滑肌細胞(VSMC)的功能[5]。VSMC的衰老，是動脈粥樣硬化、高血壓、心力衰竭等心血管疾病的重要誘因[6-7]。然而年輕Sca-1+骨髓干細胞對年老小鼠血管平滑肌細胞(old mice vascular smooth muscle cell， OMVSMC)的作用及其機制研究少見報道。為此，2017年1月至2019年11月，本研究探討了年輕Sca-1+骨髓干細胞對OMVSMC增殖的調控作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 不同年齡段小鼠細胞提取 選取2～3個月月齡C57BL/6小鼠作為年輕組(Y組)。選取22～23個月月齡C57BL/6小鼠作為年老組(O組)。提取Y組小鼠骨髓細胞，Y組及O組小鼠VSMC。

1.1.2 主要試劑及儀器 Sca-1+細胞分選試劑盒(Stem Cell Technology)；BrdU(Sigma)；血小板源生長因子B鏈的純合二聚體(PDGFBB)ELISA檢測試劑盒(R&D)；MTT細胞增殖檢測試劑盒(Abcam)；平滑肌肌動蛋白(α-SMA)熒光染色(Sigma)；Transwell室(Corning)；熒光定量PCR儀(ABI)。

1.2 方法

1.2.1 年輕Sca-1+細胞的提取及鑒定 按照Sca-1+細胞分選試劑盒使用方法，收集Y組小鼠股骨，提取小鼠骨髓細胞，通過分選試劑盒，分選Sca-1+及Sca-1-細胞，并通過流式細胞儀鑒定Sca-1+細胞比例[3]。

1.2.2 MVSMC培養(yǎng) 收集Y組及O組小鼠主動脈，分離消化后，培養(yǎng)MVSMC。并通過α-SMA熒光染色鑒定細胞[3， 8]。

1.2.3 細胞增殖檢測 BrdU染色及MTT細胞增殖檢測試劑盒檢測細胞增殖能力。

1.2.4 qRT-PCR檢測 收取OMVSMC總RNA，通過qRT-PCR檢測不同實驗組中cyclin B1、cyclin D1基因的表達。選取GAPDH作為內參對照。各基因引物見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.5 Western blot檢測 收取OMVSMC蛋白，通過Western blot檢測不同實驗組中cyclin B1、cyclin D1蛋白的表達。選取GAPDH作為內參對照。

1.2.6 年輕Sca-1+/-細胞分別與OMVSMC共培養(yǎng) Y組Sca-1+/-細胞分別培養(yǎng)于Transwell小室濾膜上方，OMVSMC培養(yǎng)于Transwell下室。無血清，低氧(0.1% O2)培養(yǎng)72 h，行BrdU染色檢測增殖細胞。提取OMVSMC總RNA及蛋白，檢測增殖相關基因及蛋白的表達。收集Y組Sca-1+/-細胞上清分別與OMVSMC共培養(yǎng)。1%血清，低氧培養(yǎng)7 d。分別于第1、3、5、7天，收取OMVSMC，通過MTT細胞增殖檢測試劑盒檢測細胞增殖能力。

1.2.7 年輕Sca-1+/-細胞旁分泌生長因子鑒定 無血清，低氧培養(yǎng)(0.1% O2)72 h后，分別收集Y組Sca-1+/-細胞及上清。參照PDGFBB ELISA 檢測試劑盒使用方法，檢測細胞及上清中PDGFBB的表達。

注：體外培養(yǎng)年輕(Y)及年老(O)VSMC圖1 α-SMA染色鑒定細胞類型

2 結果

2.1 不同年齡組MVSMC增殖能力檢測 培養(yǎng)MVSMC，并通過α-SMA熒光染色，鑒定細胞形態(tài)及類型，見圖1。與Y組相比，O組MVSMC增殖細胞(BrdU染色陽性)比例下降71%，見圖2、表2；增殖相關基因cyclin B1表達下降67%，cyclin D1表達下降57%；增殖相關蛋白cyclin B1表達下降60%，cyclin D1表達下降46%；MTT檢測細胞增殖，與Y組相比，O組MVSMC在第3、5、7天，細胞增殖能力下降，見圖3、表2。

注：A:Y組；B:O組

圖3 Western blot檢測增殖相關蛋白(cyclin B1，cyclin D1)表達

表2 不同年齡組MVSMC增殖能力、增殖相關基因及蛋白表達檢測

2.2 年輕Sca-1骨髓干細胞對OMVSMC增殖能力的調控作用 與Sca-1-細胞共培養(yǎng)組比較，Sca-1+細胞共培養(yǎng)組，增殖細胞(BrdU染色陽性)比例上升2.6倍(圖4、表3)；增殖相關基因cyclin B1表達上升2.27倍，cyclin D1表達上升2.47倍；增殖相關蛋白cyclin B1表達上升2.43倍，cyclin D1表達上升2.73倍(圖5、表3)；MTT檢測細胞增殖，證實與Sca-1-細胞共培養(yǎng)組相比，Sca-1+細胞共培養(yǎng)組，在第3、5、7天，細胞增殖能力上升，見表3。

注：A： O+Y Sca-1-組；B:O+Y Sca-1+組

表3 年輕Sca-1骨髓干細胞對OMVSMC增殖能力、增殖相關基因及蛋白表達的調控作用

圖5 Western blot檢測年輕Sca-1骨髓干細胞相關蛋白表達

2.3 年輕Sca-1骨髓干細胞旁分泌生長因子檢測 與Sca-1-細胞比較，Sca-1+細胞中，Pdgfb基因表達上升2.49倍，PDGFBB的表達上升2.7倍。與Sca-1-細胞上清相比，Sca-1+細胞上清中PDGFBB的表達上升3.31倍，見表4。

表4 年輕Sca-1骨髓干細胞旁分泌生長因子檢測

2.4 年輕Sca-1骨髓干細胞促進OMVSMC增殖的機制 中和年輕Sca-1+細胞旁分泌的PDGFBB。與Sca-1+細胞共培養(yǎng)對照組相比，中和PDGFBB組，增殖細胞(BrdU染色陽性)比例下降66%(圖6、表5)；增殖相關基因cyclin B1表達下降63%，cyclin D1表達下降68%；增殖相關蛋白cyclin B1表達下降45%，cyclin D1表達下降58%(圖7、表5)；MTT檢測細胞增殖，與對照組比較，中和PDGFBB組，在第3、5、7天，細胞增殖能力下降，見表5。

注：A:O+Y Sca-1++C組；B:O+Y Sca-1++N組

圖7 Western blot檢測中和后年輕Sca-1骨髓干細胞相關蛋白的表達

表5 OMVSMC增殖能力、增殖相關基因及蛋白表達檢測

3 討論

衰老影響了機體內源性干細胞/祖細胞的功能，衰老成為再生醫(yī)學研究的熱點問題[9]。衰老同樣影響了VSMC的增殖、遷移能力，以及細胞周期調控因子、衰老相關蛋白/酶的表達[6]。在Sca-1+骨髓干細胞的前期研究中，證實年輕Sca-1+骨髓干細胞可通過旁分泌改善年老心外膜細胞及血管內皮細胞功能，再生心肌梗死后年老小鼠心臟功能[8]。但年輕小鼠Sca-1+骨髓干細胞對OVSMC功能的調控作用研究甚少。所以本研究探討了年輕小鼠Sca-1+骨髓干細胞對OVSMC功能的調控作用，研究發(fā)現(xiàn)年輕小鼠Sca-1+骨髓干細胞可通過旁分泌PDGFBB促進OVSMC增殖。

Sca-1+干細胞在心肌損傷修復中起重要作用，Sca-1+細胞被證實可調控細胞黏附、增殖及分化[10]。Sca-1+細胞缺乏可導致小鼠心臟收縮缺陷和年齡相關的心肌肥大[11]。在心臟中過表達Sca-1可減輕心肌肥大和纖維化，恢復心臟功能[12]。更有研究證實，在心肌梗死后，Sca-1+干細胞可以被招募到新生鼠及成年小鼠心臟，從而發(fā)揮修復作用[13]。在Sca-1+心臟干細胞中的研究也同樣證實，將Sca-1+心臟干細胞移植于心肌梗死后心臟，可減小心梗范圍，恢復左室心臟功能，促進新生血管生成[14]。我們的前期研究證實，與Sca-1-細胞相比，Sca-1+骨髓干細胞可以更好地改善心肌梗死后小鼠心臟功能[3]。進一步機制研究發(fā)現(xiàn)，與Sca-1-細胞相比，Sca-1+細胞可以旁分泌更多的生長因子，其中包括PDGFBB[2-3]。本研究，我們進一步證實了年輕Sca-1+骨髓干細胞旁分泌PDGFBB再生OVSMC增殖能力的作用。

研究證實，衰老影響了VSMC的功能，并導致了衰老相關血管疾病的發(fā)生[15]。在大鼠、小鼠和人來源VSMC的研究中證實，衰老導致VSMC的增殖能力下降[16-17]。Ruiz-Torres等[18]的研究證實，人來源VSMC的遷移能力也隨年齡的增加而下降。同樣地，隨年齡增加，小鼠和人來源VSMC凋亡比例增加[16， 19]。MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、MMPs等炎癥相關因子在VSMC中的表達也隨年齡的增加而發(fā)生改變[20]。本研究我們證實，隨年齡增加，MVSMC增殖相關基因及蛋白表達下降，細胞增殖能力下降。而通過年輕Sca-1+骨髓干細胞與OVSMC共培養(yǎng)，恢復了OVSMC的增殖能力。這為年輕Sca-1+骨髓干細胞在再生醫(yī)學中的運用，提供了更多的實驗數(shù)據(jù)。也為VSMC衰老導致的動脈粥樣硬化、高血壓、心力衰竭等心血管疾病的治療提供了更多的治療手段。

PDGF家族被證實可調控VSMC功能，調控血管形成[21]。其中PDGFBB更是被證實參與VSMC表型的轉化、細胞增殖及細胞遷移能力的調控[22]。本研究我們證實，與Sca-1-細胞相比，Sca-1+細胞可以旁分泌更多的PDGFBB，從而促進OVSMC增殖。中和Sca-1+細胞分泌的PDGFBB，使Sca-1+失去促進OVSMC增殖的作用。所以我們證實，年輕小鼠Sca-1+骨髓干細胞可通過旁分泌PDGFBB促進OVSMC增殖。

綜上所述，年輕小鼠Sca-1+骨髓干細胞可通過旁分泌PDGFBB促進OVSMC增殖相關基因及蛋白的表達，促進細胞增殖。本研究進一步闡述了年輕Sca-1+骨髓干細胞對年老小鼠細胞功能的影響及分子機制，為干細胞在衰老相關疾病中運用提供了更多的實驗基礎。