周玉平，溫晉鋒，周飛，王慶領(lǐng)，楊萍，呂雪幼

（1.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 寧波 315020；2.寧波大學(xué) 消化疾病研究所，浙江寧波 315020；3.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所，浙江 寧波 315211；4.寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 護(hù)理學(xué)院，浙江 寧波 315100）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）已經(jīng)成為全球最主要的慢性肝病[1]。NAFLD長(zhǎng)期發(fā)展的結(jié)果必將導(dǎo)致非酒精性脂肪性肝纖維化（hepatic non-alcoholic steatofibrosis，NASF）[2]。系統(tǒng)評(píng)價(jià)和Meta分析顯示，肝纖維化是NAFLD死亡率的最重要預(yù)測(cè)因素，與無(wú)纖維化相比，有纖維化的NAFLD患者的全因死亡風(fēng)險(xiǎn)增加，并且該風(fēng)險(xiǎn)隨著纖維化階段的增加而增加[3]。由此可見(jiàn)，NASF是NAFLD進(jìn)展過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是導(dǎo)致其不良結(jié)局的重要原因。因此，進(jìn)一步研究NASF的發(fā)病機(jī)制及探索防治NASF的有效藥物是當(dāng)前的重大課題，但目前尚無(wú)理想的NASF動(dòng)物模型制約了相關(guān)的基礎(chǔ)研究。本研究旨在構(gòu)建一個(gè)造模時(shí)間相對(duì)較短、成功率高、重復(fù)性好的動(dòng)物模型，使之能夠較完整表達(dá)人類NASF的病理特點(diǎn)和發(fā)病機(jī)制特點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6～8周齡SFP級(jí)C57BL/6J雄性小鼠，體質(zhì)量（22±4）g，購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2018-0008。動(dòng)物飼養(yǎng)于寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，本研究獲得寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 藥物與試劑：CCl4分析純購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋氨酸-膽堿缺乏飼料（methionine-choline-deficient diet，MCD，批號(hào)TP3005G）及對(duì)照飼料（methionine-cholinesupplemented diet，MCS，批號(hào)TP3005Gs）購(gòu)自南通特洛菲飼料科技有限公司；伊紅、蘇木精、苯胺藍(lán)均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruvic transaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，AST）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、甘油三酯（triglyceride，TG）生化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組和造模：適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，小鼠隨機(jī)分成正常組、模型組，正常組8只，模型組16只。正常組給予MCS飼料喂養(yǎng)；模型組采用MCD飲食誘導(dǎo)+每周1次腹腔注射10% CCl4-橄欖油溶液（劑量為2 mL/kg），分4周組和6周組，各8只。

1.2.2 一般指標(biāo)觀察：每天觀察小鼠的一般狀況，包括自主活動(dòng)、精神狀態(tài)、毛發(fā)變化等，每周固定時(shí)間稱量體質(zhì)量，最后處死動(dòng)物后，摘取肝臟濾紙吸干表面水分稱量其濕重，計(jì)算肝臟指數(shù)（%）=肝濕重/體質(zhì)量×100%。

1.2.3 標(biāo)本留取方法：4周末取4周組、6周末取對(duì)照組和6周組小鼠進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)，動(dòng)物禁食12 h，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，打開(kāi)腹腔，下腔靜脈采血，摘取肝臟，選肝臟最大葉1塊置于4%中性甲醛溶液中固定，用于組織病理染色及免疫組化檢測(cè)；另取一較大葉切成方形，OTC包埋后液氮速凍用于冰凍切片；其余EP管分裝液氮速凍后轉(zhuǎn)移到-70 ℃保存。

1.2.4 生化指標(biāo)檢測(cè)：ALT、AST、TBIL活性檢測(cè)及血清、肝臟TG含量檢測(cè)均采用生化檢測(cè)試劑盒進(jìn)行。

1.2.5 組織病理學(xué)觀察：制作肝組織石蠟切片，行HE染色和Masson染色，觀察組織炎癥、脂肪變性和膠原增生情況。制作肝組織冰凍切片，行油紅O染色，觀察脂滴沉積情況。用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)量各個(gè)樣本的陽(yáng)性染色面積，每個(gè)樣本測(cè)量5個(gè)視野，計(jì)算出每張切片的平均陽(yáng)性面積（μm2）用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6 免疫組織化學(xué)檢測(cè)α-SMA表達(dá)：常規(guī)制作石蠟切片后二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水；3% H2O2阻斷、滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；PBS沖洗后0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)；滴加一抗（α-SMA，稀釋500倍）；4 ℃冰箱孵育過(guò)夜；室溫平衡及PBS沖洗；滴加二抗37 ℃孵育30 min；DAB反應(yīng)染色；蘇木素復(fù)染、干燥、封片；顯微鏡下觀察拍照，每張切片隨機(jī)選擇5不同的視野觀察拍照，并用Image-Pro Plus軟件測(cè)量陽(yáng)性染色面積，每個(gè)樣本測(cè)量5個(gè)視野，計(jì)算出每張切片的平均陽(yáng)性面積（μm2）用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，2組間進(jìn)一步比較采用LSD檢驗(yàn)，若不服從方差齊性，則采用Dunnett-T3檢驗(yàn)法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模后小鼠一般狀況和體質(zhì)量變化 對(duì)照組小鼠生活狀態(tài)良好，毛發(fā)光澤；模型組小鼠隨造模時(shí)間延長(zhǎng)，皮毛變得疏松油膩，精神萎靡，日漸消瘦。對(duì)照組小鼠體質(zhì)量隨時(shí)間延長(zhǎng)稍有增加，但趨于穩(wěn)定；模型組則明顯有下降趨勢(shì)，尤其在第2、第5周下降最為明顯，自第2周開(kāi)始模型組小鼠體質(zhì)量顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化比較（每組n=8，±s，g）

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化比較（每組n=8，±s，g）

組別 第1周 第2周 第3周 第4周 第5周 第6周對(duì)照組 25.06±0.91 25.31±0.72 25.54±0.98 27.11±0.15 26.70±0.95 27.88±1.17模型組 24.50±1.15 21.60±1.20 21.05±0.79 20.46±2.79 16.96±1.83 14.89±1.79 t 1.083 7.487 10.080 6.238 13.371 17.153 P 0.297 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2 造模后小鼠的肝臟變化及肝指數(shù)情況 造模后的小鼠肝臟可見(jiàn)表面光澤差，顏色偏黃白，有明顯脂肪變性，6周模型小鼠更為明顯，且部分肝臟可見(jiàn)米粒大小的結(jié)節(jié)，而對(duì)照組小鼠肝臟表面光滑，色澤粉紅，無(wú)結(jié)節(jié)，無(wú)脂肪變性（見(jiàn)圖1）。計(jì)算肝臟指數(shù)結(jié)果顯示，造模6周后肝臟指數(shù)明顯上升，顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），見(jiàn)表2。

圖1 各組小鼠肝臟外觀比較

表2 各組小鼠肝臟指數(shù)比較（每組n=8，±s）

表2 各組小鼠肝臟指數(shù)比較（每組n=8，±s）

與對(duì)照組比：aP＜0.01；與4周模型組比：bP＜0.01

組別 肝濕重（g） 肝臟指數(shù)（%）對(duì)照組 1.02±0.07 3.84±0.214周模型組 0.62±0.02a 3.40±0.066周模型組 0.62±0.07a 4.73±0.38ab F 45.879 21.200 P＜0.001 0.002

2.3 各組小鼠血清ALT、AST、TBIL活性比較 生化檢測(cè)結(jié)果顯示，相比正常組，模型組血清ALT、AST、TBIL指標(biāo)均顯著升高（P＜0.01）；6周模型組指標(biāo)升高更為明顯，較4周模型組顯著升高（P＜0.01），見(jiàn)表3。

表3 各組血清肝功能指標(biāo)比較（每組n=8，±s）

表3 各組血清肝功能指標(biāo)比較（每組n=8，±s）

與對(duì)照組比：aP＜0.01；與4周模型組比：bP＜0.01

組別 ALT（U/L） AST（U/L） TBIL（μmol/L）對(duì)照組 23.50± 4.78 153.75± 36.86 2.64±0.554周模型組 182.00±16.10a 243.25± 23.08a 5.73±0.99a 6周模型組 535.38±66.71ab 766.25±159.10ab 9.58±3.44ab F 58.702 96.555 22.087 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 各組小鼠血清和肝臟TG含量比較 生化檢測(cè)結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，模型組血清TG含量顯著下降（P＜0.01），而肝臟TG含量顯著升高（P＜0.01）；其中，6周模型組血清TG含量顯著低于4周模型組（P＜0.01），6周模型肝臟TG含量顯著高于4周模型組（P＜0.01），見(jiàn)表4。

表4 各組血清和肝臟TG含量比較（每組n=8，±s，U/L）

表4 各組血清和肝臟TG含量比較（每組n=8，±s，U/L）

與對(duì)照組比：aP＜0.01；與4周模型組比：bP＜0.01

組別 血清TG 肝臟TG對(duì)照組 1.26±0.15 188.48±22.324周模型組 1.07±0.07a 377.27±17.56a 6周模型組 0.69±0.06ab 626.10±53.19ab F 54.400 175.806 P＜0.001 ＜0.001

2.5 各組小鼠肝組織病理變化比較 HE染色、油紅O染色及Masson染色顯示，對(duì)照組肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，匯管區(qū)無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；無(wú)脂肪變性，無(wú)紅色脂滴；只在血管壁可見(jiàn)少量膠原染色。模型組肝組織可見(jiàn)匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；大量脂肪變性，胞質(zhì)內(nèi)充滿大小較一致的脂滴；膠原沉積明顯增加，竇周可見(jiàn)膠原纖維形成細(xì)絲狀甚至粗索狀分布，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，也可見(jiàn)纖維組織增生；其中6周模型的病理改變較4周模型明顯加重，見(jiàn)圖2。半定量分析顯示，模型組的脂滴和膠原面積顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；6周模型組顯著高于4周模型組（P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 各組肝組織病理染色陽(yáng)性面積比較（每n=8，±s，μm2）

表5 各組肝組織病理染色陽(yáng)性面積比較（每n=8，±s，μm2）

與對(duì)照組比：aP＜0.01；與4周模型組比：bP＜0.05

組別 油紅O染色 Masson染色 α-SMA蛋白表達(dá)對(duì)照組 758.4± 125.7 2827.7± 453.7 425.6± 37.94周模型組 71709.7± 9273.9a 26536.4±3039.7a 2233.9± 77.8a 6周模型組 119173.0±15862.9ab 35614.1±6394.8ab 2988.8±161.1ab F 94.663 102.471 470.323 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

圖2 各組小鼠肝臟組織病理學(xué)改變比較

2.6 各組小鼠肝組織α-SMA蛋白表達(dá)比較 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)α-SMA蛋白表達(dá)結(jié)果顯示：對(duì)照組肝組織見(jiàn)少量α-SMA表達(dá)在血管壁；模型組肝組織α-SMA陽(yáng)性染色明顯增多，主要見(jiàn)于匯管區(qū)，肝血竇和纖維間隔；其中6周模型的陽(yáng)性表達(dá)較4周模型明顯增加。見(jiàn)圖3。染色陽(yáng)性面積的半定量分析顯示，模型組陽(yáng)性表達(dá)面積顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；6周模型組又顯著高于4周模型組（P＜0.01），見(jiàn)表5。

圖3 各組小鼠肝組織α-SMA蛋白免疫組織化學(xué)染色（×100）

3 討論

NASF的基礎(chǔ)研究及新藥開(kāi)發(fā)是肝病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，研制理想的動(dòng)物模型是當(dāng)前需要迫切解決的問(wèn)題。NAFLD模型較為成熟，其中高脂飲食、MCD飲食誘導(dǎo)的模型應(yīng)用最為廣泛[4]。雖然NAFLD模型研究取得了較大進(jìn)展，然而，構(gòu)建由單純性脂肪肝過(guò)渡到非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatchepatitis，NASH）再到肝纖維化肝硬化這樣反映NAFLD全病程的動(dòng)物模型的方法并不多見(jiàn)。雖然高脂飲食和MCD飲食誘導(dǎo)的模型能較好地模擬NASH的病理特點(diǎn)，但較難出現(xiàn)纖維化和肝硬化改變。NASF模型復(fù)制較為困難，一定程度上制約了相關(guān)的基礎(chǔ)和藥物開(kāi)發(fā)研究。

有研究者將MCD飲食喂養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至8周，以期復(fù)制簡(jiǎn)易可靠的NASF模型，結(jié)果雖然小鼠肝臟出現(xiàn)嚴(yán)重的脂肪變性，但Masson染色結(jié)果提示肝纖維化僅為1-2級(jí)[5]。劉洋等[6]的6周MCD小鼠模型發(fā)現(xiàn)，雖然MCD組小鼠肝組織中α-SMA、COL1A1、TGF-β1等纖維化相關(guān)的mRNA表達(dá)顯著升高，但組織病理學(xué)檢測(cè)仍未見(jiàn)明顯的肝纖維化改變。雖然膽堿缺乏并添加乙硫氨酸飲食模型可復(fù)制NASF病理過(guò)程，短期喂食可使動(dòng)物肝臟發(fā)生脂肪變性、炎癥，長(zhǎng)期喂食則可使動(dòng)物肝臟發(fā)生纖維化、硬化甚至肝癌，但此方法的缺點(diǎn)是動(dòng)物體質(zhì)量下降超過(guò)20%，死亡率非常高，大大增加實(shí)驗(yàn)的難度，并降低了可重復(fù)性。蓋曲倞等[7]對(duì)該模型經(jīng)過(guò)改良大大降低了死亡率，成功建立小鼠NASH及肝纖維化的模型，但造模時(shí)間需要16周。高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠模型出現(xiàn)肝纖維化，造模時(shí)間則更久，一般需要24周以上[8-9]。TSUCHIDA等[10]報(bào)道了一種可迅速進(jìn)展為肝纖維化和肝癌的NASH小鼠模型，研究者給予C57BL/6J小鼠富含高脂、高糖和高膽固醇的飲食，結(jié)合每周在腹腔內(nèi)給予低劑量的促進(jìn)劑CCl4，建立了一種具有快速?gòu)V泛纖維化和肝細(xì)胞癌進(jìn)展的NASH小鼠模型，在12周可產(chǎn)生第3階段纖維化，并且在24周發(fā)展成肝癌，該模型12周可出現(xiàn)明顯肝纖維化改變，且動(dòng)物死亡率低，是目前較為理想的模型，但造模時(shí)間仍相對(duì)較長(zhǎng)，且高糖、高脂、高膽固醇的飲食不符合我國(guó)的飲食特點(diǎn)。

可見(jiàn)目前NASF動(dòng)物模型存在病理改變不明顯、造模周期長(zhǎng)、動(dòng)物死亡率高、重復(fù)性差等問(wèn)題，有必要進(jìn)一步改良或研制新的模型。本課題組在大量文獻(xiàn)調(diào)研基礎(chǔ)上提出了一種新的造模方案：即在常規(guī)MCD飲食誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上，反復(fù)給予低劑量的CCl4的腹腔注射，結(jié)果顯示，該方法6周能較好模擬NASF病理表現(xiàn)，出現(xiàn)嚴(yán)重脂肪變、肝臟炎癥及明顯的肝纖維化改變（分級(jí)為3～4級(jí)），肝纖維化形成關(guān)鍵細(xì)胞即星狀細(xì)胞活化的標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)也顯著增多，血清肝功能明顯異常，肝臟脂肪含量顯著增多且無(wú)動(dòng)物死亡情況。需要指出的是，此種模型與大部分NAFLD患者存在代謝綜合征的表型有所差異，我們觀察到小鼠攝入MCD后，攝食量有所減少，體質(zhì)量逐漸下降，且血脂水平顯著降低，這是本模型的不足之處。

MCD飲食誘發(fā)的C57BL/6J小鼠模型的造模原理是通過(guò)飲食中蛋氨酸與膽堿的缺乏造成線粒體β-氧化功能障礙和極低密度脂蛋白合成與分泌減少，從而使TG在肝細(xì)胞內(nèi)迅速大量堆積，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性，造成“第一次打擊”[11]；進(jìn)而，由于肝細(xì)胞的脂肪變性，線粒體減少對(duì)游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）的攝入，促使FFA的β-氧化增加，導(dǎo)致ROS的合成和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，形成對(duì)肝臟的“第二次打擊”，最終導(dǎo)致NASH的發(fā)生[12]。CCl4具有肝毒性，進(jìn)入機(jī)體后在肝內(nèi)產(chǎn)生活化氧自由基，過(guò)氧化作用增強(qiáng)，加快肝脂肪變性進(jìn)程，損傷肝細(xì)胞，造成肝細(xì)胞變性壞死，引起細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積而成肝纖維化，其代謝產(chǎn)物還可以刺激肝臟枯否細(xì)胞，釋放促炎性細(xì)胞因子，進(jìn)一步加重肝臟的損傷。CCl4誘導(dǎo)的化學(xué)肝損傷是經(jīng)典的肝纖維化模型，但其發(fā)病機(jī)制、病程演變過(guò)程和組織形態(tài)的改變都與人類脂肪肝差異較大，高濃度CCl4造模藥物毒性強(qiáng)，肝細(xì)胞壞死、炎癥和纖維化發(fā)生早而嚴(yán)重，動(dòng)物死亡率高[13]。本研究聯(lián)合MCD飲食和反復(fù)的低劑量注射CCl4，揚(yáng)長(zhǎng)避短，成功復(fù)制了NASF模型，符合人類NASF的發(fā)病機(jī)制和病理表現(xiàn)特點(diǎn)，可用于臨床藥效評(píng)價(jià)和新藥研究。