歐陽勇，劉彥，葉洋波

（杭州市富陽區(qū)第一人民醫(yī)院 血管外科，浙江 杭州 311400）

腹主動(dòng)脈瘤（abdominal aortic aneurysm，AAA）是常見的慢性主動(dòng)脈退行性疾病，具有高發(fā)病率和高病死率，嚴(yán)重危害中老年人生命健康。臨床研究發(fā)現(xiàn)，主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）異常增殖、巨噬細(xì)胞浸潤和基質(zhì)降解與AAA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。但是，有關(guān)AAA發(fā)展過程中的炎癥浸潤和VSMCs增殖和凋亡的調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。近年研究發(fā)現(xiàn)微小RNA（miRNA）在AAA組織中異常表達(dá)，且與其發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2-3]。已有研究表明，過表達(dá)miRlet-7a可下調(diào)炎癥反應(yīng)[4]，過表達(dá)miR-21可抑制VSMCs增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)AAA的發(fā)展[5]。此外，LIU等[6]研究發(fā)現(xiàn)，miR-19a在AAA組織中高表達(dá)，但其在AAA的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過檢測(cè)miR-19a在AAA患者AAA組織和血清中的表達(dá)水平，探討miR-19a對(duì)主動(dòng)脈VSMCs生物學(xué)行為以及炎癥浸潤的影響和作用機(jī)制，以期為AAA臨床治療提供潛在靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 收集臨床樣本：組織標(biāo)本為2015年3月至2017年6月于杭州市富陽區(qū)第一人民醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的15例AAA患者的腹主動(dòng)脈組織和器官移植中心行肝臟、腎臟器官移植術(shù)（供體排除AAA以及其他腹主動(dòng)脈相關(guān)病變）15例患者殘留的部分正常腹主動(dòng)脈組織。血清樣本來源于15例AAA患者和同期進(jìn)行體檢的15例健康者。手術(shù)前均告知患者并簽署知情同意書，并獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 細(xì)胞和主要試劑：人主動(dòng)脈VSMCs（BNCC340185）和人單核巨噬細(xì)胞THP-1（BNCC100407）均購自廣州北納生物科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640購自美國Thermo Fisher公司；細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM/F12和α-MEM、胰蛋白酶和胎牛血清均購于美國Gibco公司；miR-19a inhibitor/mimic，pcDNA3.1-CDKN2B質(zhì)粒以及陰性對(duì)照均由上海吉馬公司合成；TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen公司；LipofectamineTM3000和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；Transwell小室購自美國康寧公司；ELISA試劑盒購于美國Sigma Aldrich公司；兔抗人細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2B（cyclin dependent kinase inhibitor 2B，CDKN2B）、β-actin單克隆抗體和HRP山羊抗鼠IgG均購自美國Cell Signaling Technology公司；青霉素、鏈霉素、BCA蛋白定量試劑盒、CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 巨噬細(xì)胞分離和培養(yǎng)：采用淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)基從AAA患者和健康體檢者外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞。采用PBS緩沖液按照1:1的比例稀釋肝素化的血清，2000 r/min離心20 min，收集乳白上清液，再加入4 mL細(xì)胞洗滌液于2000 r/min離心20 min即可得到外周血單個(gè)核細(xì)胞。隨后，將分離得到的外周血單核細(xì)胞懸液置于含有10%的胎牛血清、雙抗（100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）、25 ng/mL單核細(xì)胞集落刺激因子的α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：采用含有10%的胎牛血清和雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)VSMCs和采用RPMI-1640培養(yǎng)THP-1細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長密度達(dá)到80%時(shí)，以2×105個(gè)/孔的濃度接種到6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。鋪板24 h內(nèi)，培養(yǎng)至細(xì)胞單層密度達(dá)到50%～60%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將VSMCs或THP-1細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-19a inhibitor、miR-19a mimic和pcDNA3.1-CDKN2B。轉(zhuǎn)染后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h，更換雙倍血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)miR-19a的表達(dá)水平：收集組織、血清樣本和處理后的細(xì)胞，采用TRIzol提取細(xì)胞中總RNA，并采用NanoDrop檢測(cè)RNA的濃度。隨后，采用一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，嚴(yán)格按照qPCR試劑盒說明書檢測(cè)miR-19a表達(dá)水平，以U6為內(nèi)參。miR-19a上游引物為5’-CTGGAGTGTGCAAATCTA TGC-3’，下游引物為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6上游引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’，下游引物為5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平：收集處于對(duì)數(shù)期的VSMCs和THP-1細(xì)胞，采用RAPI裂解液提取細(xì)胞中的總蛋白，檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。進(jìn)行10% SDS-PAGE分離蛋白、電轉(zhuǎn)膜法將目的條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后分別加入CDKN2B（1:1000）和β-actin抗體（1:1000），4 ℃孵育過夜。之后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1:2000）室溫孵育2 h。最后，進(jìn)行ECL染色，凝膠成像儀采集圖像；通過ImageJ分析灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 CCK-8檢測(cè)VSMCs細(xì)胞增殖活力：將經(jīng)轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染處理的VSMCs細(xì)胞培養(yǎng)至處于對(duì)數(shù)生長期后，以2×104個(gè)/孔的濃度接種于96孔板中，并在每孔中加入100 μL DMEM培養(yǎng)基（含有50%巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清），每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、24、48、72和96 h后，向每孔中加入10 μL CCK-8溶液（0.5 mg/mL）后繼續(xù)于培養(yǎng)箱中孵育4 h后，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的每孔光密度（OD450）值。

1.2.6 Transwell檢測(cè)VSMCs細(xì)胞遷移能力：將經(jīng)轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染處理的VSMCs細(xì)胞培養(yǎng)至處于對(duì)數(shù)生長期后，以1×105個(gè)/孔的濃度接種于Transwell小室上室，下室加入500 μL混合培養(yǎng)基（250 μL巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液和250 μL DMEM/F12培養(yǎng)基）后常規(guī)培養(yǎng)24 h。采用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，并于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)算侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VSMCs凋亡情況：取各組細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于96孔板中，過夜培養(yǎng)后用胰蛋白酶消化細(xì)胞，PBS洗滌后加入300 μL結(jié)合液重懸，加入10 μL Annexin V-FITC室溫避光孵育15 min，再加入5 μL PI溶液染色，混合均勻后避光孵育5 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡百分比。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-19a和CDKN2B的靶向關(guān)系：由湖南普拉特澤生物科技有限公司構(gòu)建CDKN2B基因的3’UTR，插入pGL3-Promoter質(zhì)粒載體中，將該重組質(zhì)粒命名為pGL3-CDKN2B-3’UTR WT，采用基因突變法定點(diǎn)突變獲得CDKN2B突變型載體（pGL3-CDKN2B-3’UTR MUT）。然后，將HEK 293T細(xì)胞接種于12孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～70%時(shí)分別將miR-19a mimic和mimic-NC，CDKN2B野生型載體、CDKN2B突變型載體共轉(zhuǎn)染于HEK 293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染6 h后更換為新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)36 h。最后，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9 ELISA檢測(cè)炎性因子的表達(dá)水平：將經(jīng)轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染處理的THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于含有50%巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)結(jié)束后嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)TL-1β、TNF-α和IL-6的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS22.0對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，2組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-19a在AAA組織和血清中高表達(dá) RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-19a在AAA組織中的表達(dá)水平明顯高于正常腹主動(dòng)脈組織（P＜0.01）。與健康組比，miR-19a在AAA患者血清中的表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.01）。見圖1。

圖1 miR-19a在AAA患者組織（A）和血清（B）中的表達(dá)

2.2 敲降miR-19a可顯著抑制VSMCs增殖、遷移和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，敲降miR-19a可明顯下調(diào)miR-19a在VSMCs中的表達(dá)水平（P＜0.01），見圖2A；CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，敲降miR-19a后VSMCs增殖活力明顯低于對(duì)照組（P＜0.01），見圖2B；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，敲降miR-19a可顯著誘導(dǎo)VSMCs凋亡水平（P＜0.01），見圖2C；Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示，敲降miR-19a可顯著抑制VSMCs遷移能力（P＜0.01），見圖2D。

2.3 敲降miR-19a抑制THP-1細(xì)胞炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）的表達(dá) ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，敲降miR-19a可明顯抑制THP-1細(xì)胞中炎癥因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的表達(dá)水平（P＜0.01），見圖3A-C。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，敲降miR-19a可明顯抑制單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平（P＜0.01），見圖3D。由此可知，敲降miR-19a可明顯抑制THP-1細(xì)胞中炎癥因子和THP-1細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)水平。

圖2 敲降miR-19a對(duì)VSMCs增殖、凋亡和遷移（×100）的影響

2.4 miR-19a靶向負(fù)調(diào)CDKN2B的表達(dá) 通過比對(duì)TargetScan數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，CDKN2B是miR-19a的潛在靶基因，其結(jié)合位點(diǎn)如圖4A所示。同時(shí)，雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果表明，相比于對(duì)照組（mimic-NC），過表達(dá)miR-19a可顯著減少野生型CDKN2B質(zhì)粒的熒光素酶活性（P＜0.01），但對(duì)突變型CDKN2B質(zhì)粒熒光素酶的活性沒有影響，見圖4B。Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-19a可顯著下調(diào)VSMCs中CDKN2B蛋白的表達(dá)水平（P＜0.01），見圖4C。

2.5 miR-19a靶向CDKN2B抑制VSMCs增殖、侵襲和誘導(dǎo)凋亡 Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組比，過表達(dá)CDKN2B可顯著上調(diào)VSMCs中CDKN2B蛋白的表達(dá)水平（P＜0.01），但同時(shí)過表達(dá)miR-19a和CDKN2B后VSMCs中CDKN2B的表達(dá)水平與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖5A。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，過表達(dá)CDKN2B可顯著抑制VSMCs增殖活力（P＜0.01），見圖5B。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組比，過表達(dá)CDKN2B可顯著誘導(dǎo)VSMCs凋亡水平（P＜0.01），見圖5C。Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示，過表達(dá)CDKN2B后VSMCs遷移能力明顯低于對(duì)照組（P＜0.01），見圖5D。但同時(shí)過表達(dá)miR-19a和CDKN2B后可明顯緩解僅過表達(dá)CDKN2B對(duì)VSMCs增殖、凋亡和遷移的調(diào)控作用（P＜0.01），見圖5B-D。

圖3 敲降miR-19a對(duì)THP-1細(xì)胞炎癥因子和MMP表達(dá)的影響

2.6 miR-19a靶向CDKN2B下調(diào)THP-1細(xì)胞炎癥因子和MMPs的表達(dá)水平 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，過表達(dá)CDKN2B可顯著下調(diào)TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)水平（P＜0.01），但同時(shí)過表達(dá)miR-19a和CDKN2B可緩解僅過表達(dá)CDKN2B對(duì)炎癥因子的抑制作用（P＜0.01），見圖6。Western blot檢測(cè)證實(shí)，相比于對(duì)照組，過表達(dá)CDKN2B可顯著抑制MCP-1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)水平（P＜0.01）；但同時(shí)過表達(dá)CDKN2B和miR-19a后MCP-1、MMP-2及MMP-9蛋白的表達(dá)水平與對(duì)照組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖5A。

3 討論

AAA是一種嚴(yán)重的遲發(fā)性血管疾病，病死率高。近年來，miRNA被廣泛報(bào)道通過調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為，進(jìn)而參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。LI等[7]研究表明，miR-19a可作為心臟、血管和神經(jīng)元相關(guān)疾病的早期診斷和治療靶點(diǎn)。MENG等[8]研究發(fā)現(xiàn)，miR-183和miR-141與AAA的不良預(yù)后密切相關(guān)。過表達(dá)miR-155-3p通過促進(jìn)VSMCs的增殖和抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)AAA的發(fā)生與發(fā)展[9]。PENG等[10]研究表明，過表達(dá)miR-26a通過靶向PTEN促進(jìn)VSMCs增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而誘導(dǎo)AAA的發(fā)展。同時(shí)，前期研究也證實(shí)，異常表達(dá)的miR-19a與炎癥和腫瘤密切相關(guān)[11-12]。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，miR-19a在AAA主動(dòng)脈壁組織和血清中高表達(dá)；敲降miR-19a可顯著抑制VSMCs增殖和遷移能力，以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；同時(shí)，敲降miR-19a抑制了THP-1細(xì)胞因子和MMPs的表達(dá)。機(jī)制上，miR-19a通過靶向下調(diào)CDKN2B的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)VSMCs增殖和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和MMPs的表達(dá)，從而加速AAA的發(fā)展進(jìn)程。

圖5 miR-19a靶向CDKN2B對(duì)VSMCs增殖、凋亡和細(xì)胞遷移（×100）的影響

圖6 miR-19a靶向CDKN2B對(duì)THP-1細(xì)胞炎癥因子表達(dá)水平的影響

巨噬細(xì)胞是炎癥和免疫學(xué)的關(guān)鍵細(xì)胞之一，miR-19a在多種炎癥遞質(zhì)作用下表達(dá)增強(qiáng)[13-14]。巨噬細(xì)胞的存在可損傷動(dòng)脈壁，因?yàn)榫奘杉?xì)胞產(chǎn)生的MMPs可以降解血管管壁中層彈力纖維，造成血管壁順應(yīng)性降低，并在血流的沖擊作用下加劇瘤體擴(kuò)張，使膠原蛋白產(chǎn)生崩解[15]。例如，敲降miR-33-5p可通過緩解THP-1炎癥因子的表達(dá)和MMPs的表達(dá)，進(jìn)而緩解AAA的發(fā)展進(jìn)程[16]。同時(shí)，ZHANG等[17]研究結(jié)果證實(shí)，敲降miR-155通過抑制THP-1細(xì)胞炎癥反應(yīng)和MMPs的表達(dá)，進(jìn)而緩解血管緊張素II誘導(dǎo)小鼠AAA形成。miR-195通過抑制炎性因子和MMPs的表達(dá)，緩解了AAA的發(fā)展進(jìn)程[18]。與前期研究一致，本研究發(fā)現(xiàn)miR-19a水平在AAA患者組織和血清中高表達(dá)。同時(shí)，敲降miR-19a抑制了THP-1細(xì)胞上清液中炎癥因子的表達(dá)水平以及主動(dòng)脈彈性蛋白的表達(dá)。此外，過表達(dá)miR-19a促進(jìn)了VSMCs的遷移。以上研究結(jié)果提示，抑制炎癥反應(yīng)和MMPs的表達(dá)可預(yù)防AAA動(dòng)脈壁破裂的發(fā)生。

CDKN2B作為多種惡性腫瘤的抑癌基因，通過介導(dǎo)細(xì)胞增殖、周期和凋亡進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)展進(jìn)程[19-20]。在血管系統(tǒng)中，CDKN2B通過介導(dǎo)p53參與血管重塑[21]。LEEPER等[22]研究表明，敲降CDKN2B通過上調(diào)p53的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈瘤的形成。GAO等[23]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-15a通過靶向抑制CDKN2B上調(diào)平滑肌細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)AAA的發(fā)展進(jìn)程。同時(shí)，本研究結(jié)果同樣證實(shí)，敲降miR-19a通過靶向上調(diào)CDKN2B抑制平滑肌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以及緩解THP-1細(xì)胞上清炎癥因子和MMPs的表達(dá)，進(jìn)而緩解AAA的發(fā)展進(jìn)程。由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)資料我們推斷，miR-19a/CDKN2B分子軸在AAA的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，并且調(diào)控VSMCs增殖、凋亡和細(xì)胞遷移以及炎性細(xì)胞浸潤，但其能否作為新的治療靶點(diǎn)投入到臨床中還需要進(jìn)一步深入研究。