何鳴霞，來錦，翁益琴，馬泳泳，林峰洋，邢沖云，江松福

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 血液內(nèi)科，浙江 溫州 325015）

B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤（B-cell non-Hodgkin’s lymphoma，B-NHL）是一類異質(zhì)性明顯的惡性腫瘤[1]。近年來，抗CD20單克隆抗體（利妥昔單抗）聯(lián)合CHOP的化療方案的應(yīng)用顯著提高了療效，成為目前的一線治療方案[2-5]。但始終有部分患者難免復(fù)發(fā)，并對現(xiàn)有的挽救治療發(fā)生耐藥，針對這部分患者的有效治療手段仍然非常有限。對于初次復(fù)發(fā)后對化療敏感的受試者再次化療后中位生存期只有10個月[6]。嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T cells，CART）治療是一種腫瘤特異性的T細(xì)胞療法，通過基因工程改造T細(xì)胞使其能夠識別并結(jié)合特異性腫瘤相關(guān)抗原，從而發(fā)揮靶向殺傷作用，達(dá)到抗腫瘤效應(yīng)[7]。CD19作為B細(xì)胞重要的調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)于B細(xì)胞幾乎整個細(xì)胞生命周期，直至消失于終末漿細(xì)胞分化期，并在促進(jìn)B細(xì)胞分化及維持生存過程中起重要作用。由于CD19在絕大多數(shù)B細(xì)胞和95%的B-NHL細(xì)胞中表達(dá)，且其表達(dá)僅局限于B細(xì)胞及卵泡DC細(xì)胞，避免了“脫靶”毒性的產(chǎn)生，使得其成為B-NHL治療的潛在靶點(diǎn)之一[8-11]。本研究旨在觀察在復(fù)發(fā)、難治性B-NHL患者中應(yīng)用CART治療的有效性及安全性。

1 資料和方法

1.1 一般資料 2017年4月至2018年10月間共10例復(fù)發(fā)性難治性B-NHL患者在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院接受CD19-CART細(xì)胞免疫治療。所有患者腫瘤細(xì)胞均表達(dá)CD19。所有患者均簽署知情同意書。該研究經(jīng)由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。所有患者在接受CART治療前均接受過多次化療，化療療程9.5（5.8，14.3）次，1例患者此前接受過自體造血干細(xì)胞移植。接受CART治療前的疾病狀態(tài)均為復(fù)發(fā)難治且未緩解[12]，見表1。

表1 10例患者既往治療過程

1.2 CART細(xì)胞制備及輸注 CART細(xì)胞均由第三方制備，屬于第2代CART細(xì)胞產(chǎn)品。CART細(xì)胞結(jié)構(gòu)包括胞外區(qū)域、跨膜區(qū)域及胞內(nèi)區(qū)域三部分，分別由抗CD19scFv、跨膜區(qū)和4-1BB或CD28/CD3ζ信號區(qū)。其中8例患者使用小鼠來源的嵌合抗原受體，2例患者采用人源化嵌合抗原受體。首先使用細(xì)胞單采機(jī)（COM.TEC，德國Fresenius公司）采集患者外周血淋巴細(xì)胞，制備過程均在符合GMP標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室完成，具體過程包括質(zhì)粒構(gòu)建，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化提取，慢病毒包被，磁珠分選CD3+T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染，CART細(xì)胞培養(yǎng)、檢測、計(jì)數(shù)、回輸。采集至回輸?shù)拈g隔時間為43（29～124）d，回輸前2～5 d均給予FC（氟達(dá)拉濱25 mg/m2+環(huán)磷酰胺500 mg/m2）方案預(yù)處理，目的在于清除患者體內(nèi)淋巴細(xì)胞以便輸入CART細(xì)胞的增殖并減少高級別的細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS）發(fā)生。

1.3 療效及不良反應(yīng)判定標(biāo)準(zhǔn) 采用2014版Lugano標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行淋巴瘤療效評估[12]，分為完全緩解（complete response，CR）、部分緩解（partial response，PR）、疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）及疾病進(jìn)展（progressive disease，PD），7例患者采用普通CT作為評估手段，3例患者采用PET-CT評估療效。不良反應(yīng)主要關(guān)注CRS，根據(jù)LEE等[13]提出的修訂的CRS分級系統(tǒng)進(jìn)行分級，CRS等級每天至少評估1次，并且當(dāng)患者的狀態(tài)發(fā)生變化時隨時進(jìn)行評估。根據(jù)不良事件的常用術(shù)語標(biāo)準(zhǔn)（CTCAE）v4.0.3對神經(jīng)病學(xué)和其他一般不良事件（adverse events，AEs）進(jìn)行分級。

1.4 隨訪及檢測 輸注CART后中位隨訪9（1～24）個月，隨訪截至2019年6月15日。在CART輸注期21 d內(nèi)嚴(yán)密監(jiān)測患者各項(xiàng)生命體征及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，常規(guī)1、3、7 d監(jiān)測各項(xiàng)指標(biāo)，4周內(nèi)每周隨訪，6個月內(nèi)每月隨訪，18個月內(nèi)每3個月隨訪，18個月后可每6個月隨訪，目前最長隨訪期約為24個月。隨訪評估內(nèi)容主要包括療效、不良反應(yīng)評估及CART拷貝數(shù)的監(jiān)測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以±s形式表示，不符合正態(tài)分布以M（P25，P75）表示；計(jì)數(shù)資料以數(shù)值或百分比表示；生存分析采用Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者特征 10例接受CD19-CART細(xì)胞治療的BNHL患者均為復(fù)發(fā)難治且處于未緩解狀態(tài)。CART治療前的化療療程為9.5（5.8，14.3）次，共1例患者接受過自體造血干細(xì)胞移植。男6例，女4例，年齡48.0（33.8，52.5）歲。原發(fā)疾病全部為B細(xì)胞惡性淋巴瘤，其中彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）8例，濾泡淋巴瘤（follicular lymphoma，F(xiàn)L）向DLBCL轉(zhuǎn)化1例，F(xiàn)L 1例。疾病分期7例患者為IV期，1例為II期，2例為I期。IPI評分2例為高危，3例中高危，1例中低危，4例低危。輸注CART細(xì)胞距離疾病初次確診的時間為12.2（6.5，23.9）個月，9例患者為一次性輸注，1例患者分2次輸注，輸注細(xì)胞總量為14.4（8.3，39.0）×107，單位體質(zhì)量的細(xì)胞數(shù)為1.0（1.0，2.1）×106/kg?；颊叩囊话闱闆r及治療特征見表2。

表2 患者的一般情況及治療特征

2.2 CART療效 10例患者輸注CART細(xì)胞后，3例達(dá)CR，4例達(dá)到PR，總體有效率為70%。輸注CART后，通過PCR的方法檢測其在外周血中的擴(kuò)增情況，全部患者外周血中均能檢測到CART細(xì)胞增殖。CART細(xì)胞的中位峰值拷貝數(shù)約15.0×104（7.6×102，2.3×105）copies/μg，達(dá)峰時間為10.5（7.0，21.0）d。CART細(xì)胞增殖到達(dá)峰值后往往快速下降，大部分患者持續(xù)約3個月。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測CAR+細(xì)胞占CD3+細(xì)胞比例，CAR+細(xì)胞比例峰值為4.35%（0.91%，9.22%），擴(kuò)增達(dá)峰時間為12.0（9.0，17.5）d，同PCR方法測得的CART擴(kuò)增吻合。輸注CART后中位隨訪9個月，隨訪截至2019年6月15日。其中最長隨訪時間約為24個月，此患者在CART輸注后達(dá)持續(xù)的CR至今。其中6例患者在隨訪期內(nèi)死亡，7例患者在不同時間點(diǎn)出現(xiàn)疾病進(jìn)展。所有患者OS為（10.5±4.0）月，PFS為（4.6±3.9）月，生存曲線見圖1A-B。采用Ann Arbor疾病分期分組進(jìn)行生存分析發(fā)現(xiàn)，分期≥3期的患者較＜3期的患者OS及PFS均更短，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2A-B；不同IPI評分患者之間的預(yù)后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3A-B。其中1例患者在CART輸注后6個月左右疾病進(jìn)展，予以依布替尼及來那度胺協(xié)同CART無效，后予2次輸注人源化CD19-CART細(xì)胞（來源于第一次輸注前所制備細(xì)胞）疾病仍未能控制，予以使用Venatoclax（Bcl-2抑制劑）口服治療，后死于疾病再次進(jìn)展。另1例患者疾病進(jìn)展后予以Venatoclax聯(lián)合RICE方案多次化療，后Venatoclax聯(lián)合來那度胺維持治療，目前存活。

圖1 全部患者生存分析

圖2 不同疾病分期患者的生存分析

2.3 CART治療相關(guān)的CRS反應(yīng)及神經(jīng)毒性 8例患者在CART輸注后發(fā)生不同程度的CRS反應(yīng)，其中7例為低級別CRS，5例為1級CRS，2例2級CRS，僅1例患者發(fā)生4級CRS。同時除發(fā)生4級CRS的患者合并有4級神經(jīng)毒性外，其余患者均未出現(xiàn)腦病。共2例患者使用IL-6受體抑制劑托珠單抗，其中1例同時使用了糖皮質(zhì)激素。發(fā)生4級CRS的患者在輸注期第10天出現(xiàn)原發(fā)性腹膜炎，轉(zhuǎn)氨酶升高，低纖維蛋白原血癥，凝血功能障礙等，在使用IL-6抑制劑雅美羅240 mg/d，地塞米松20 mg q12治療后CRS癥狀減輕；第17天突發(fā)意識障礙及癲癇發(fā)作，經(jīng)神經(jīng)內(nèi)科聯(lián)合會診后考慮CRES 4級，經(jīng)鎮(zhèn)靜、甘露醇降顱壓、德巴金抗癲癇等對癥支持治療，后家屬要求自動出院，于輸注后第18天死亡。其余患者的CRS在嚴(yán)密監(jiān)測及積極處理下均得到有效控制并快速緩解。所有患者出現(xiàn)體溫大于38 ℃的時間為輸注后5（0，11）d；體溫峰值為38.9（38.0，40.4）℃，持續(xù)3（1，12）d左右。患者在CRS發(fā)生時檢測到IL-6的快速升高，較基線升高4.0（1.0，31.5）倍，在CRS控制時快速回落。

3 討論

B細(xì)胞淋巴瘤在經(jīng)過傳統(tǒng)的抗腫瘤治療后往往難逃復(fù)發(fā)、難治的結(jié)局。單克隆抗體-利妥昔單抗的出現(xiàn)使得表達(dá)CD20的B細(xì)胞淋巴瘤的患者生存時間有了明顯延長，然而仍然有相當(dāng)部分患者最終因復(fù)發(fā)和難治而死亡[14]。靶向腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原的CART療法在免疫治療中取得顯著療效，目前在全世界范圍內(nèi)開展的CART療法的注冊臨床研究超過200項(xiàng)，主要集中在美國和中國。

2008 年，有研究指出經(jīng)基因修飾的特異性靶向B淋巴細(xì)胞的自身T細(xì)胞可以安全治療B細(xì)胞腫瘤[15]。2010年KOCHENDERFER等[16]應(yīng)用二代CD19-CART細(xì)胞治療1例復(fù)發(fā)難治FL患者，CART細(xì)胞體內(nèi)持續(xù)時間達(dá)27周，最終達(dá)PR。后該團(tuán)隊(duì)又分別在2012[17]、2015[18]、2017年[19]分別報(bào)道了其成功治療多種類型NHL的研究成果，均顯示出一定的有效性。2014年第56屆美國血液學(xué)會年會上，美國國家癌癥研究所報(bào)告顯示：利用反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的19～28zCART治療B淋巴細(xì)胞腫瘤患者，27例可評估病例中有22例獲得CR或PR，其中1例患者CR持續(xù)37個月[20]。CART的應(yīng)用使B細(xì)胞淋巴瘤的生存率和治愈率均得到進(jìn)一步提高，其中NEELAPU等[21]報(bào)道的成果中客觀緩解率（objective remission rate，ORR）達(dá)82%，CR率達(dá)54%；同時15.4個月的中位隨訪期，40%的患者持續(xù)緩解。回顧已有的研究成果，多數(shù)臨床研究ORR率為64%～82%，CR率43%～71%，維持緩解最久在38月以上[18-19，21-24]。本研究提示總緩解率達(dá)70%，CR率達(dá)30%，CR最長持續(xù)時間約24個月，且目前仍處于持續(xù)緩解及隨訪中。相較于其他團(tuán)隊(duì)，本研究中短期ORR率達(dá)國際平均水平，CR率稍低，長期緩解率方面，除1例患者外大部分患者療效無法長時間維持，PFS及OS有待提高，可能與病例原發(fā)病侵襲性較強(qiáng)，分期更高，既往經(jīng)歷三線以上方案化療患者占比高（達(dá)80%）相關(guān)，另由于病例數(shù)有限、隨訪時間短，尚未獲得更全面及長期隨訪數(shù)據(jù)。以上提示CD19-CART療法在復(fù)發(fā)難治CD19+B細(xì)胞淋巴瘤中初步出顯示療效，但較CD19-CART在急性淋巴細(xì)胞白血病中的緩解持續(xù)時間仍明顯縮短[25]，淋巴瘤本身的異質(zhì)性、內(nèi)部物理屏障及腫瘤的免疫微環(huán)境等可能是阻礙其持續(xù)緩解的因素。CART后的維持治療可能有助于降低復(fù)發(fā)，例如聯(lián)合來那度胺等免疫調(diào)節(jié)劑或PD-1等免疫檢查點(diǎn)抑制劑。

CRS和神經(jīng)毒性是CART細(xì)胞治療常見的不良反應(yīng)之一，其他常見不良反應(yīng)包括中性粒細(xì)胞減少、貧血、血小板減少等。CRS通常認(rèn)為是由于T細(xì)胞的擴(kuò)增激活其他免疫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等）導(dǎo)致的一種非抗原特異性毒性，與包括IL-6和IFN-γ等在內(nèi)的細(xì)胞因子循環(huán)水平的升高相關(guān)[13，26-27]。CRS通常表現(xiàn)為全身癥狀，如發(fā)熱、低血壓、低氧血癥，但可影響體內(nèi)任何器官系統(tǒng)，包括心血管、呼吸系統(tǒng)、皮膚、胃腸、肝、腎、血液和神經(jīng)系統(tǒng)，表現(xiàn)為器官功能障礙。嚴(yán)重的可出現(xiàn)凝血功能障礙、毛細(xì)血管滲漏及巨噬細(xì)胞活化綜合征/嗜血細(xì)胞綜合征，甚至可能危及生命。IL-6受體抑制劑托珠單抗和糖皮質(zhì)激素可用于控制CRS[27-29]。本研究提示CRS發(fā)生率占全部患者的80%，其中1～2級發(fā)生率為70%，3～5級發(fā)生率為10%。其中1例CRS 4級患者在使用托珠單抗及糖皮質(zhì)激素治療后仍出現(xiàn)4級神經(jīng)毒性，考慮可能與IL-6受體抑制劑使用后中樞IL-6濃度升高相關(guān)[30]。2017年SCHUSTER等[24]報(bào)道CTL019治療復(fù)發(fā)難治性NHL研究，其中1/5的患者發(fā)生嚴(yán)重CRS，約1/3患者發(fā)生短暫腦病，11%的患者發(fā)生嚴(yán)重腦病。而我們的高級別CRS及腦病發(fā)生率明顯較低，提示嚴(yán)密的監(jiān)測及積極的管理包括積極使用IL-6拮抗劑有助于控制相關(guān)不良反應(yīng)，防止高級別CRS的發(fā)生。

綜上，CD19-CART在復(fù)發(fā)難治性B-NHL中顯示出初步療效，其可作為復(fù)發(fā)難治患者的挽救治療，不良反應(yīng)較小，經(jīng)嚴(yán)密監(jiān)測及積極管理不良反應(yīng)可逆且可控，但長期療效有待隨訪觀察。