潘璐璐，盧孔場，褚茂平，曾靜靜，榮星

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 兒童心臟中心 溫州醫(yī)科大學(xué)心臟發(fā)育與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，浙江 溫州 325027；2.溫州市婦幼保健所 兒童健康管理科，浙江 溫州 325000）

川崎?。↘awasaki disease，KD）是一種常見急性發(fā)熱出疹性疾病，表現(xiàn)為全身血管炎綜合征，好發(fā)于5歲以下嬰幼兒[1]。在發(fā)達(dá)國家中，這種疾病已成為兒童獲得性心臟病的主要原因[2]。中國作為一個(gè)發(fā)展中國家，KD發(fā)病率也在逐年增長[3]。KD可累及全身各個(gè)器官，主要表現(xiàn)為心血管系統(tǒng)損傷，而冠脈損害是其主要危害，損傷機(jī)制可能歸結(jié)于冠狀動脈及其他中等肌性血管的內(nèi)皮及彈性纖維的損傷，從而導(dǎo)致血管炎和血管壁的破壞，最終導(dǎo)致冠狀動脈擴(kuò)張甚至冠狀動脈瘤的發(fā)生。鑒于KD目前臨床無特異性的診斷指標(biāo)，尋找其診斷、治療、預(yù)后的新一代血清生物標(biāo)志物顯得尤為重要。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200 nt的非編碼RNA，基因組序列中4%～9%的序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本是lncRNA（相應(yīng)的蛋白編碼RNA的比例是1%）。由于lncRNA在多種體液如血液、尿液中均可檢測出，使其成為了新一代生物標(biāo)志物的熱門候選。為此，本研究通過lncRNA芯片系統(tǒng)分析KD患兒血清中的lncRNA表達(dá)譜，篩選KD患兒特異相關(guān)的循環(huán)lncRNA RP11-86H7.1，并分析lncRNA RP11-86H7.1在KD診斷中的臨床意義，為KD治療尋找靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院2018年4月至2018年12月確診并收治的KD患兒25例，KD診斷依據(jù)美國心臟協(xié)會制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。25例中男17例，女8例，年齡＜5歲，經(jīng)超聲檢測，存在冠脈損害13例，無冠脈損害12例。選擇同期門診體檢健康兒童24例、普通發(fā)熱兒童17例及KD恢復(fù)期兒童22例，年齡＜5歲，排除肺、肝、腎、腦等重大疾病。各組研究對象的年齡、性別構(gòu)成差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。本研究方案由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

表1 4組研究對象一般臨床資料的比較（±s）

表1 4組研究對象一般臨床資料的比較（±s）

KD急性期兒童冠脈損害 無冠脈損害例數(shù) 24 17 22 13 12性別（男/女） 14/10 10/7 11/11 8/5 9/3月齡 25.00±15.74 49.27±32.78 27.00± 18.30 18.23± 14.72 21.00± 8.89白細(xì)胞（×109/L） 8.14± 2.13 10.86± 6.04 7.47± 2.51 15.57± 4.64 13.72± 3.39血小板（×109/L） 303.33±47.07 262.40±68.10 538.14±183.00 371.00±131.23 411.33± 87.01 C反應(yīng)蛋白（mg/L） - 20.85±18.04 13.88± 9.65 84.92± 53.66 58.32± 35.94谷丙轉(zhuǎn)氨酶（U/L） 15.67± 3.55 15.47± 7.95 28.36± 15.56 70.38± 92.80 32.42± 42.91谷草轉(zhuǎn)氨酶（U/L） 35.00± 5.69 33.40±10.74 40.23± 10.91 42.85± 25.79 33.75± 16.67腦鈉肽（pg/mL） - - 297.23±136.65 1013.31±875.08 502.58±324.12 D-二聚體（μg/mL） - - 1.38± 1.90 1.31± 0.74 2.11± 2.52臨床特點(diǎn) 健康兒童 發(fā)熱兒童 KD恢復(fù)期兒童

1.2 方法

1.2.1 樣本采集：空腹采取靜脈血2 mL，放置30 min后，1200×g離心10 min，吸取上清液至離心管中，4 ℃，12000×g離心10 min后分離上清至新離心管中，取250 μL血清加入750 μL TRIzol@LS試劑（美國Invitrogen公司）后所有血清樣本均儲存于-80 ℃，直至使用。

1.2.2 總RNA提取及cDNA第1鏈合成：從-80 ℃冰箱中取出血清樣本冰上放置待解凍后加入200 μL氯仿劇烈震蕩30 s，室溫放置3 min，4 ℃ 12000 r/min離心15 min后，取上清液400 μL于新去RNase的EP管內(nèi)，加入等量異丙醇-20 ℃過夜后，4 ℃ 12000 r/min離心20 min，棄上清后加入1 mL 75%乙醇洗滌，12000 r/min離心后加入10 μL DEPC水溶解RNA，利用Trans Script?One-Step g DNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.3 RT-qPCR檢測血清lncRNA RP11-86H7.1表達(dá)：以cDNA為模版，在Bio-Rad CFX96 Touch PCR儀上，RT-qPCR對lncRNA RP11-86H7.1進(jìn)行定量檢測。lncRNA RP11-86H7.1上游引物：5’-CTCGGCTTCTCCTT ACCTT-3’，下游引物：5’-ACACCACCAATCTGAACCA-3’；以Has-GAPDH為內(nèi)參，上下游引物分別為：5’-AACTCT GGTAAAGTGGATATTG-3’，5’-GGTGGAATCATATTGGAAC A-3’。按照試劑盒說明書，反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃3 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，65 ℃ 5 s，擴(kuò)增39個(gè)循環(huán)。所有樣品均做3個(gè)平行孔，循環(huán)數(shù)取其均數(shù)。lncRNA RP11-86H7.1的相對表達(dá)量用2-△△Ct表示，△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，2組比較采用配對t檢驗(yàn)；利用ROC曲線分析和AUC評估血清lncRNA作為疾病診斷標(biāo)志物的價(jià)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA RP11-86H7.1在KD患者血清中的表達(dá)

KD急性期與健康兒童、普通發(fā)熱兒童及KD恢復(fù)期血清lncRNA相對表達(dá)量分別為6.33±7.37，1.57±1.59，1.61±1.13及1.37±0.56，KD急性期患兒血清lncRNA RP11-86H7.1表達(dá)水平明顯高于健康兒童和普通發(fā)熱兒童（P＜0.05），而KD恢復(fù)期即下降至接近健康兒童水平。見圖1。

圖1 KD急性期、健康兒童、普通發(fā)熱兒童及KD恢復(fù)期血清lncRNA表達(dá)水平

2.2 血清lncRNA RP11-86H7.1水平對KD的診斷效能 繪制ROC曲線，評價(jià)lncRNA RP11-86H7.1在KD中的診斷價(jià)值。如圖2所示，血清lncRNA RP11-86H7.1診斷KD的ROC曲線的AUC為0.783（95%CI=0.586～0.981，P＜0.05），當(dāng)臨界值（診斷閾值）取2.29時(shí)，其靈敏度為60.0%，特異度為91.7%，具有較高的診斷價(jià)值。

2.3 KD患者血清lncRNA RP11-86H7.1表達(dá)水平與KD臨床特征關(guān)系 lncRNA RP11-86H7.1在血小板計(jì)數(shù)高于300×109/L的兒童血清中的表達(dá)明顯高于血小板計(jì)數(shù)正常兒童的血清（P＜0.05），而在其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

3 討論

圖2 lncRNA RP11-86H7.1對KD急性期診斷作用的ROC曲線

表2 lncRNA RP11-86H7.1與KD臨床特征相關(guān)性分析

KD是一種在兒童時(shí)期能引起全身系統(tǒng)血管炎的嚴(yán)重發(fā)熱疾病，且與成年期的冠狀動脈病變存在極大的相關(guān)性，而發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。內(nèi)皮損傷被證實(shí)是早期心血管疾病的危險(xiǎn)標(biāo)志物，可影響正常的穩(wěn)態(tài)功能并有炎癥活動特點(diǎn)[4-5]。目前已有報(bào)道，有KD病史的兒童在成年期出現(xiàn)冠狀動脈粥樣硬化導(dǎo)致了急性冠狀動脈綜合癥或猝死[6]。因此及時(shí)診斷KD是預(yù)防冠狀動脈并發(fā)癥的最佳手段。

miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，目前在心血管病中已研究的較為透徹。如已有報(bào)道m(xù)iRNA不僅可以作為KD診斷的標(biāo)記物，而且可以成為KD冠脈損害治療的靶點(diǎn)[7-8]。而lncRNAs是長度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯、mRNA剪切、miRNA吸附及作為蛋白骨架等多種方式發(fā)揮重要作用[9]。但lncRNAs在心血管疾病中的研究報(bào)道較少。有報(bào)道lncRNA Fendrr通過結(jié)合在組蛋白修飾復(fù)合體PRC2上，在胎鼠心臟及腹壁發(fā)育過程中起重要的調(diào)節(jié)作用[10]。WANG等[11]鑒定了一種心臟富含的lncRNAs，稱為心臟肥大相關(guān)表觀遺傳調(diào)節(jié)器（chaer），它對心臟肥大的發(fā)展起調(diào)節(jié)作用，在心臟出現(xiàn)壓力超負(fù)荷之前抑制chaer的表達(dá)可顯著減輕心臟肥大和功能障礙。KO等[12]進(jìn)一步了解了KD和冠狀動脈瘤的發(fā)病機(jī)制，通過lncRNA分析表明XLOC_是最高表達(dá)的分子，冠狀動脈瘤患者的XLOC_豐度顯著增加，表明CD177 pos中性粒細(xì)胞的增加與KD有關(guān)，研究還提供了KD、抗IVIG的KD或冠狀動脈瘤患者血液中的全長非編碼RNA轉(zhuǎn)錄物，流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明遺傳因素是重要的KD易感性。KIM等[13]為了確定影響KD易感性的遺傳變異，進(jìn)行了一項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)研究和復(fù)制研究，3個(gè)位點(diǎn)的6個(gè)單核苷酸多態(tài)性與KD易感性顯著相關(guān)。JIANG等[14]探討lncRNAs在KD中的作用時(shí)，在KD模型中篩選出妊娠誘導(dǎo)的非編碼RNA（PINC）在經(jīng)TNF-α處理的HUVEC中顯著過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PINC的敲除增強(qiáng)了用TNF-α處理的人內(nèi)皮細(xì)胞的生存能力，增加了抗凋亡的表達(dá)，降低了凋亡基因的表達(dá)。提示PINC參與了TNF-α誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的過程，可能成為KD治療的新靶點(diǎn)。LI等[15]研究表明THRIL表達(dá)與KD兒童的一種急性炎癥疾病患者癥狀的嚴(yán)重程度相關(guān)。lncRNAs和其結(jié)合蛋白可以調(diào)節(jié)TNF-α表達(dá)在人類先天免疫反應(yīng)和炎癥性疾病中扮演著重要角色。由此可見，lncRNAs在多種心血管疾病中發(fā)揮極為重要的作用，為心血管疾病治療提供了新的靶點(diǎn)。

綜上所述，盡管已可以證明lncRNAs的異常表達(dá)與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)，但有關(guān)lncRNAs在KD的報(bào)道中只進(jìn)行了一般性的論述，沒有對候選的lncRNAs進(jìn)行單獨(dú)研究，在KD中的作用機(jī)制研究尚不深入。本研究結(jié)果提示，血清lncRNA RP11-86H7.1表達(dá)上調(diào)可作為診斷和評估KD預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。本研究通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，lncRNA RP11-86H7.1在KD患者血清中的表達(dá)明顯升高，將血清lncRNA RP11-86H7.1作為KD診斷指標(biāo)，其靈敏度和特異度均大于60%。但本研究所納入樣本量有限，仍存在偶然誤差的可能，其靈敏度和特異度以及臨界值的選擇還需在大樣本量的人群中進(jìn)一步驗(yàn)證。