易路遙 楊婷婷 李 杰 劉緒平 吉偉佳 占翌領 章 紅

(江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術研究中心, 南昌 330029)

香料是化妝品中使用次數(shù)最多，也是使用范圍最廣的一類添加劑，然而逐年增加的化妝品不良反應[1，2]報道顯示，香料是引起皮膚病不良反應的常見致敏物質(zhì)之一。據(jù)統(tǒng)計，化妝品過敏中至少有35%是由香料引起的[3]。新鈴蘭醛因具有持久的鈴蘭花香香韻和清淡而甜潤的兔耳草花香氣[4]，被廣泛用于各種香型香精的調(diào)配，在各種百花香型的香水、香皂和化妝品中均有使用[5]。然而，該物質(zhì)的過敏性已得到大量試驗數(shù)據(jù)及化妝品過敏的不良反應案例支持[6，7]。2017年8月2日，歐盟委員會正式發(fā)布了(EU)2017/1410號法規(guī)[8]，在禁用物質(zhì)清單附錄II中增加了新鈴蘭醛( CAS 31906-04-4和CAS 51414-25-6兩個同分異構體)。東盟化妝品委員會在2018年1月就正式發(fā)布指令禁止在化妝品中使用新鈴蘭醛。我國《化妝品安全技術規(guī)范》2015年版未將新鈴蘭醛列入禁用物質(zhì)表，考慮到歐盟是我國進出口化妝品的重要市場，無論是從企業(yè)對外出口化妝品還是從未來化妝品的使用安全考慮，我國將新鈴蘭醛列入禁用組分表是必然的趨勢，因此盡早建立新鈴蘭醛的檢測方法十分必要。

目前我國新鈴蘭醛的企業(yè)標準不包含檢測方法[9]，文獻報道的氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[10，11]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[12，13]測定致敏性芳香劑及香料類過敏原物質(zhì)殘留的基質(zhì)分別為塑料玩具及化妝品，但文獻報道的化妝品的前處理過于簡單，缺乏凈化步驟，可操作性不強。歐盟檢測消費品中香料過敏原的標準方法[14]有僅適用于直接定容進樣基質(zhì)的GC-MS法、國外還有一些文獻報道[15,16]HPLC法及分散液液微萃取GC-MS法測定化妝品中其他過敏香料。本研究改進了歐盟標準方法的樣品前處理，使用新型固相填料，采用通過式SPE凈化進行樣品前處理，使檢測方法適用性更廣，再結合GC-MS /MS 聯(lián)用技術進行定性定量分析，由于化妝品基質(zhì)種類繁多，所含化學成分不下十幾種，采用二級質(zhì)譜在排除樣品基質(zhì)可能帶來的干擾更有優(yōu)勢，定性更加準確，為化妝品中致敏香料的檢測提供科學可行的方法依據(jù)。

1 試驗部分

1．1 儀器與試劑

Agilent 7000C 三重串聯(lián)四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS/MS)(Agilentgs公司，美國)，彈性石英毛細管柱(30m×0.25mm,1.0μm)HP-5MS、(30m×0.25mm,0.25μm)HP-5MS、(50m×0.32mm,0.5μm)HP-FFAP、(30m×0.32mm,0.25μm)DB-17MS、(60m×0.32mm,0.5μm) HP-INNOWA ( Agilent 公司，美國)；離心機(ThermoFisher公司，美國)；渦旋混合器(IKA公司，德國)。

新鈴蘭醛對照品 (貨號C 14232000，批號：111528，新鈴蘭醛Ⅰ∶新鈴蘭醛Ⅱ=72∶28)購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；甲醇為色譜純(Sigma)；無水Na2SO4為分析純(國藥集團)；Oasis PRiME HLB(200mg,6mL)、Oasis PRiME MCX(150mg,6mL)、Oasis HLB(60mg,3mL)(waiers公司，美國)。

美白晚霜、天然純露保濕霜(兒童型)、淡斑乳、調(diào)理精華乳、凈膚修護乳、祛痘爽膚水、茶樹爽膚水、女士淡香水和少女香氛香水均為國產(chǎn)、男士香水為法國生產(chǎn)。

1．2 方法

1.2.1標準儲備溶液的制備

稱取新鈴蘭醛標準品0.1g( 精確至0.1mg，市面上僅有新鈴蘭醛同分異構體的混合對照品，按照歸一化法 新鈴蘭醛Ⅰ∶新鈴蘭醛Ⅱ=72∶28換算各自的濃度) 至10mL棕色容量瓶中，甲醇定容，得到濃度為新鈴蘭醛Ⅰ7.2mg/mL和新鈴蘭醛Ⅱ2.8mg/mL的混合標準儲備溶液，置于4℃避光保存。

1.2.2供試品溶液的制備

稱取1.0 g(精確至0.001g)試樣置于25 mL比色管(有10 mL刻度)中，加入甲醇約5 mL，于超聲波清洗儀上超聲15 min，再定容到10mL，混勻，以10000 r/ min高速離心15 min，取上清液加入2 g無水Na2SO4脫水，取2mL清液作為待凈化液，置于通過式SPE小柱Oasis PRiME HLB(200mg,6mL)，直接收集流出液，經(jīng)0.22μm有機濾膜過濾,濾液供測定用(凝膠、爽膚水類樣品如基質(zhì)雜質(zhì)干擾較少，可不通過SPE小柱，取上清液直接過濾膜上機測定，香水類樣品取樣量為0.1 g)。

1.2.3色譜-質(zhì)譜條件

HP-5MS 毛細管柱(30m×0.25mm,1.0μm)，載氣為高純氦氣，流量為1.0mL/min ，程序升溫：初始溫度為60℃，保持2min 后以13℃/min 速率升至280℃，保持1min，進樣口溫度為280℃ ，進樣模式為分流進樣，分流比5∶1 ；EI 質(zhì)譜測定條件: 70 eV，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，傳輸線溫度280℃，碰撞氣體(N2)流量為1.5mL/min，淬滅氣體(He)流量為2.25 mL/min；溶劑延遲5min。數(shù)據(jù)采集方式: 多反應監(jiān)測( MRM) ，目標物對照品總離子流圖(TIC)及二級質(zhì)譜棒狀圖見圖1、圖2、圖3，目標物離子對信息見表1。

圖1 新鈴蘭醛GC-MS/MS 總離子流色譜圖

圖2 新鈴蘭醛Ⅰ二級質(zhì)譜圖

圖3 新鈴蘭醛Ⅱ二級質(zhì)譜圖

表1 新鈴蘭醛Ⅰ和新鈴蘭醛Ⅱ質(zhì)譜信息

2 結果與討論

2.1 色譜質(zhì)譜條件的選擇和優(yōu)化

在色譜條件建立過程中，首先針對氣相毛細管色譜柱進行了弱極性到極性的比較選擇，分別用液膜厚0.25μm 的HP-5MS毛細管柱、液膜厚1.0μm 的HP-5MS毛細管柱、DB-17MS毛細管柱、HP-INNOWAX毛細管柱及HP-FFAP毛細管柱對標準品溶液進行分析，其中HP-5MS和DB-17MS出峰峰形較好，HP-5MS分離度較DB-17MS稍好，而HP-5MS液膜厚1.0μm比0.25μm的分離度更好，尤其表現(xiàn)在對大批量樣品溶液進行分析時，故選擇液膜厚1.0μm的HP-5MS毛細管柱，而DB-17MS毛細管柱可以作為備選在必要時起到排除雜質(zhì)的作用，文獻[14]就是選擇了DB-17MS和VF-WAX兩種極性的毛細管色譜柱，本實驗未選擇類似VF-WAX強極性的柱子，是考慮到實驗對象沒有文獻[14]多，HP-5MS毛細管柱既能滿足本實驗對象較好的分離又是常規(guī)實驗室必備的基礎氣相色譜柱，且較VF-WAX柱有極低的色譜柱流失特性，極高的耐高溫特性及壽命長等。

程序升溫比較了文獻[14]的方法：初始溫度為60℃，保持1min 后以3℃/min 速率升至230℃，然后10℃/min速率升至260℃考慮到歐盟的方法主要針對20幾個實驗對象的同時分離，且所使用的色譜柱最高溫度限較低，所以設置了較緩的梯度，導致新鈴蘭醛直到40min左右才出峰，而實驗中建立的程序升溫在16min附近即可出峰，分離度還優(yōu)于文獻[14]，且本實驗選擇的色譜柱最高溫度限達350℃，可以在梯度后端直接上升到280℃高溫進行快速的雜質(zhì)掃尾，故最終選擇速率程序升溫到280℃高溫的條件。

質(zhì)譜條件優(yōu)化先確定了新鈴蘭醛Ⅰ和Ⅱ一級質(zhì)譜SCAN模式下的基豐離子136和105為母離子，再采用反應產(chǎn)物離子模式下設置梯度遞增碰撞電壓(5ev～40ev，10ev間隔)分別進行轟擊，分析各電壓下的二級碎片離子強度，選擇較特征的二級定量及定性離子，再在多反應監(jiān)測模式(MRM)下優(yōu)化各離子對的最佳碰撞電壓。

2.2 提取溶劑的選擇

化妝品的大部分方法均采用甲醇提取，前期簡單比較了甲醇和乙腈，甲醇極性大，適用的基質(zhì)會更廣一些，且考慮到氣相分析極少使用乙腈作為溶劑，乙腈毒性更大，就最終選擇了甲醇，由于要上氣相色譜，還增加了無水硫酸鈉除水的步驟，甲醇作為溶劑對氣相毛細管色譜柱會有一定溶解損傷，所以進樣的時候設置分流比是有必要的。

2.3 固相萃取條件的優(yōu)化

2.3.1SPE方案設計篩選

為了得到較干凈的樣品處理液，本研究考慮采用固相萃取這種目前通用的有機物凈化手段來進行凈化，而為了建立專屬性好的SPE前處理方案，根據(jù)新鈴蘭醛化合物偏堿性的特征，試驗設計比較PRiME HLB、PRiME MCX、HLB等不同填料的SPE柱，其中PRiME是新型適用于通過式處理方案的柱子，相對于傳統(tǒng)的SPE柱有更簡單、更快速、更潔凈的優(yōu)勢，針對3款SPE柱，分別進行標準品過柱、樣品基質(zhì)過柱、樣品基質(zhì)過柱后添加標準品、樣品基質(zhì)添加標準品過柱4種設計分析，實驗選用霜、乳、爽膚水3種代表性基質(zhì)考察，標準品柱前柱后的添加量均使得最后上機的分析溶液濃度為4μg/mL。結果顯示，標準品過柱實驗中，PRiME HLB回收率110.6%、HLB回收率83.4%、PRiME MCX回收率48.6%；樣品基質(zhì)過柱實驗中，未過柱的霜和乳樣品溶液色譜圖干擾峰遠遠多于過柱的，其中HLB去除干擾效果最佳，其次是PRiME HLB，PRiME MCX最多，爽膚水的3款柱子雜峰基本差不多；樣品基質(zhì)過柱后添加標準品和樣品基質(zhì)添加標準品過柱的實驗中，通過提取后的樣品中目標物峰面積與提取后加標的樣品中目標物峰面積之比計算回收率，霜和乳的PRiME HLB回收率105.0%～120.0%、HLB回收率56.5%～26.7%、PRiME MCX回收率80.5%～96.1%，爽膚水的PRiME HLB回收率110.0%、HLB回收率78.0%、PRiME MCX回收率97.1%，進一步結合基質(zhì)效應試驗結果綜合選擇最佳SPE柱。

2.3.2基質(zhì)效應實驗

基質(zhì)效應(ME)的計算等于2.3.1方案設計中各樣品基質(zhì)過柱后加標樣品的目標物響應與對應濃度的標準品溶液的響應的百分比再減去100，如果結果為負數(shù)，則為基質(zhì)抑制，如果結果為正，則為基質(zhì)增強。本研究結果顯示，霜和乳的基質(zhì)效應PRiME MCX較強抑制(-68.1%～45.0%)，HLB和PRiME HLB為略微增強(18.0%～9.0%)，爽膚水的基質(zhì)效應PRiME MCX一般抑制，HLB和PRiME HLB為略微增強。

綜合比較，最后選擇PRiME HLB(200mg 6ml)作為凈化柱。推薦測定過程中使用待測樣本相似的基質(zhì)的陰性溶液配制標曲。

2.4 方法學驗證

2.4.1基質(zhì)匹配工作標準曲線

精密吸取標準儲備溶液適量，用甲醇配制合適濃度的標準中間使用溶液，再用按照1.2.2方法制備的陰性基質(zhì)溶液配制基質(zhì)匹配工作標準曲線，濃度范圍新鈴蘭醛Ⅰ為0.36mg/L ～ 7.2mg/L，新鈴蘭醛Ⅱ為0.14mg/L ～ 2.58mg/L，注入設定好色譜質(zhì)譜條件的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，記錄峰面積，繪制標準曲線，將標準工作溶液按濃度從低到高依次進行測定，以得到的定量離子色譜峰的峰面積(新鈴蘭醛Ⅰ：136.0/107.1，新鈴蘭醛Ⅱ：105.0/77.0)為縱坐標，對應的進樣濃度為橫坐標作圖，繪制標準工作曲線，如表2所示(霜基質(zhì)匹配工作曲線)，新鈴蘭醛Ⅰ和新鈴蘭醛Ⅱ在其線性范圍內(nèi)，濃度值與峰面積有良好的線性關系，線性相關系數(shù)均大于0.9900。

表2 新鈴蘭醛Ⅰ和新鈴蘭醛Ⅱ基質(zhì)標準曲線

2.4.2精密度試驗

精密量取標準曲線溶液中間濃度點(新鈴蘭醛Ⅰ2.88mg/L，新鈴蘭醛Ⅱ1.12mg/L)的溶液，注入氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，重復進樣6 次，測定，記錄峰面積，計算新鈴蘭醛Ⅰ和Ⅱ均小于5%，儀器精密度滿足實驗要求。

2.4.3回收率及重復性試驗

實驗選取了霜、乳、爽膚水及香水4種較為典型的化妝品基質(zhì)作為本底，分別設定了3 個添加濃度，霜、乳、爽膚水添加濃度為5mg/kg、10mg/kg、40mg/kg，香水添加濃度為50mg/kg、100mg/kg、400mg/kg，添加濃度以新鈴蘭醛Ⅰ計算，新鈴蘭醛Ⅱ按照比例計算，采用1.2項下的試驗方法，對10mg/kg添加濃度平行6份試驗，另外兩個添加濃度平行3份試驗。由結果可知，方法對于不同化妝品基底物質(zhì)的回收率在80.0%～118.0%之間，相對標準偏差(RSD) 小于10%，其中重復6份回收試驗新鈴蘭醛Ⅰ含量RSD為9.0%，新鈴蘭醛Ⅱ含量RSD為11.2%，方法重復性滿足試驗需求。

2.4.4定量限實驗

以響應信號大于噪聲10 倍時對應的標液濃度作為儀器定量限，在測定膏、霜、乳類、凝膠、爽膚水類樣品時，新鈴蘭醛Ⅰ和Ⅱ方法定量限LOQ為0.1mg/kg，在測定香水樣品時，新鈴蘭醛Ⅰ和Ⅱ方法定量限LOQ為1mg/kg。

2.5 實際樣品的測定

采用建立的上述方法對10批樣品開展了分析，其中霜2批，乳液3批，爽膚水2批，香水3批，結果顯示，其中1批調(diào)理精華乳檢出20.4mg/kg，1批男士香水(歐盟)檢出110mg/kg，考慮乳類化妝品是混合香料中含有新鈴蘭醛香料，香水是一款歐盟禁用前生產(chǎn)的某知名品牌，應為直接使用新鈴蘭醛進行調(diào)香。

3 結論

本研究建立的是測定膏霜乳液類和液態(tài)水基類化妝品中新鈴蘭醛氣質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜測定的定量定性方法。對色譜質(zhì)譜條件及固相萃取方案進行了優(yōu)化，完成了基質(zhì)效應及方法學驗證等評價，本實驗方法將通過式SPE凈化處理方案與質(zhì)譜檢測結合，實現(xiàn)了化妝品中致敏香料的快速檢測分析，該分析方法快速，準確，選擇性好，為化妝品的質(zhì)量安全檢測提供了有效的技術手段。