林 彤，廖賢平（廣州東仁醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，廣州 510440）

男性不育癥是指未采取任何避孕措施，夫婦同居一年以上由于男性方面的原因?qū)е屡讲荒苁茉姓?。隨著社會(huì)的快速發(fā)展，生活節(jié)奏的不斷變化，不育癥患病率近年來(lái)呈明顯上升的趨勢(shì)，影響了世界范圍內(nèi)大約15%的育齡夫婦，其中男性不育癥占20%[1-2]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，微小核糖核酸(microRNA，miR)參與細(xì)胞周期、凋亡的調(diào)控，在精子形成和早期胚胎發(fā)育等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其中miR-145 與精子的發(fā)生、凋亡關(guān)系密切相關(guān)[3-4]。本研究通過(guò)檢測(cè)男性不育癥患者精漿miR-145 表達(dá)水平，分析miR-145 診斷男性不育癥的價(jià)值，旨在為男性不育癥的診斷及靶向治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2017年1月～2018年9月深圳市龍華區(qū)婦幼保健院收治的男性不育癥患者130例，年齡25 ～46（34.20±5.35）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合世界衛(wèi)生組織《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②婚后性生活正常，未避孕1年以上因男方原因不育者。另招募同期體檢正常的生育男性50 例為正常對(duì)照組，年齡24 ～43（32.80±4.90）歲。

1.2 主要儀器及試劑 WLJY-9000 偉力彩色精子檢測(cè)系統(tǒng)（北京偉力公司）。TaqMan MicroRNA Reverse Transcription 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，TaqMan miRNA qPCR 試劑盒，TaqMan small RNA 引物（5×），Taq Man small RNA 引物（20×），ABI 7500 型熒光定量PCR 儀均購(gòu)自美國(guó)ABI 有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本采集：采集精液前禁欲3 ～7 天，自慰法收集精液于干燥消毒的無(wú)菌容器中，置37℃恒溫箱中溫育30 min，液化后先行精液常規(guī)檢查，然后1 500 r/min 離心10min，再以12 000 r/min 離心5 min，取上清（精漿）保存于-80℃待檢。

1.3.2 精漿RNA 提取：取200μl 預(yù)處理的精漿加入1ml TRIzol 中充分均勻，將勻漿液倒入1.5ml 離心管中，再依次加入氯仿、異丙醇及95ml/dl 乙醇，提取總RNA。

1.3.3 miR-145檢測(cè)：在ABI 7500型熒光定量PCR 儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)。反應(yīng)體系為20μl：TaqMan MicroRNA Assay 1.00μl，cDNA 1.33μl，TaqMan 2×Universal PCR Master Mix 10.00μl，ddH2O 7.67 μl， 混合后離心放入定量PCR 儀。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性10 min、95℃變性15 s、60℃復(fù)性60 s 進(jìn)行45 個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。以U6 為內(nèi)參照，采用2- △△Ct法計(jì)算miR-145 的相對(duì)表達(dá)水平，其中△Ct=Ct目的基因-CtU6。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（+s）表示，組間比較采用成組t檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征曲線（ROC）分析miR-145 對(duì)男性不育癥的診斷價(jià)值。相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 男性不育癥組和對(duì)照組精液常規(guī)主要參數(shù)及精漿中miR-145 表達(dá)水平比較 見(jiàn)表1。男性不育癥組精漿中miR-145 表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；男性不育癥組精子濃度、精子存活率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率及正常精子形態(tài)百分率明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 男性不育癥組和對(duì)照組精液常規(guī)主要參數(shù) 及精漿中miR-145 表達(dá)水平比較（+s）

表1 男性不育癥組和對(duì)照組精液常規(guī)主要參數(shù) 及精漿中miR-145 表達(dá)水平比較（+s）

項(xiàng) 目 對(duì)照組（n=50）男性不育癥組（n=130） t P精子濃度(×106/ml) 112.50±46.35 70.24±28.60 4.852 0.012精子存活率(%) 73.84±5.82 38.40±7.60 11.238 ＜0.001前向運(yùn)動(dòng)精子百分率(%) 46.20±5.30 17.52±9.73 10.816 ＜0.001正常精子形態(tài)百分率(%) 9.25±1.70 2.60±1.42 8.913 ＜0.001 miR-145 1.16±0.35 3.92±0.86 7.540 ＜0.001

2.2 精漿miR-145 表達(dá)水平對(duì)男性不育癥的診斷價(jià)值 見(jiàn)圖1。精漿中miR-145 表達(dá)水平診斷男性不育癥的曲線下面積（area under curve, AUC）為0.864（95%CI：0.807 ～0.925），當(dāng)miR-145 取最佳診斷截?cái)嘀禐?.15 時(shí)，其敏感度和特異度分別為92.8%和75.0%。

圖1 精漿miR-145 表達(dá)水平診斷男性不育癥的ROC 曲線

2.3 精漿中miR-145 表達(dá)水平與精液參數(shù)的相關(guān)性分析 見(jiàn)圖2。Pearson 相關(guān)分析顯示，男性不育癥患者精漿中miR-145 表達(dá)水平與精子濃度、精子存活率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率均呈正相關(guān)（r=0.427，0.604，0.538，P＜0.01），與正常精子形態(tài)百分率無(wú)相關(guān)性（r=0.121，P＞0.05）。對(duì)照組精漿中miR-145 表達(dá)水平與精子濃度、精子存活率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率及正常精子形態(tài)百分率均無(wú)明顯相關(guān)性（r=0.153，0.106，0.117，0.096，P＞0.05）。

圖2 男性不育癥患者精漿中miR-145 表達(dá)水平與精液參數(shù)的相關(guān)性

3 討論

男性不育癥是多因素相互作用而引起的疾病，其發(fā)病機(jī)制包括遺傳因素和環(huán)境因素的相互作用，其中遺傳因素被認(rèn)為是導(dǎo)致人類生精功能損傷的重要因素[5]。microRNA 是一類長(zhǎng)度為21～25 nt 的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA 小分子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移及分化等過(guò)程，在激素、內(nèi)分泌干擾素和營(yíng)養(yǎng)狀況等多種因素作用下發(fā)生特異性變化[6-7]。有研究表明，microRNA 在男性不育、精囊腺及前列腺疾病中異常表達(dá)，與精子發(fā)生、發(fā)育和成熟的過(guò)程關(guān)系密切[8-9]。CHEN 等[10]使用RT-PCR 技術(shù)分析了豬類精液中microRNA 的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)精子參數(shù)異常的精液中microRNA 的表達(dá)序列與正常對(duì)照組相比存在差異。

本研究顯示，男性不育癥組精子濃度、精子存活率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率及正常精子形態(tài)百分率明顯低于對(duì)照組，男性不育癥組精漿中miR-145 表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，提示精漿中miR-145 在男性不育癥患者中呈高表達(dá)，其可能參與男性不育癥的發(fā)生發(fā)展。KOTAJA 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，精漿中microRNA 表達(dá)水平上調(diào)，可能與精子的減少有關(guān)，這為了解男性不育癥的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。本研究通過(guò)相關(guān)分析顯示，男性不育癥患者精漿中miR-145 表達(dá)水平與精子濃度、精子存活率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率均呈正相關(guān)。提示miR-145 的高表達(dá)可能影響精子的質(zhì)量。NOVESKI 等[12]研究表明，正常的精子發(fā)生與生精障礙的microRNA 具有不同的表達(dá)模式，這些差異表達(dá)的microRNA 與男性不育癥有關(guān)。本研究應(yīng)用ROC 曲線分析顯示，精漿中miR-145 表達(dá)水平診斷男性不育癥的AUC 為0.864（95%CI：0.807～0.925），當(dāng)miR-145 取最佳診斷截?cái)嘀禐?.15 時(shí)，其敏感度和特異度分別為92.8%和75.0%。提示精漿中miR-145 表達(dá)水平可能是評(píng)估男性生殖能力的生物學(xué)指標(biāo)，有望為男性不育癥提供新的治療靶點(diǎn)。WANG 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，精漿中microRNA 在無(wú)精子癥中顯著降低，但在弱精子癥中增加，精漿中microRNA 的測(cè)定為診斷男性不孕癥提供了一種新的無(wú)創(chuàng)方法。另有研究顯示，正常對(duì)照者和不育男性中microRNA表達(dá)存在明顯差異，microRNA 有潛力作為新的無(wú)創(chuàng)生物學(xué)標(biāo)志物來(lái)診斷男性不育癥[14]。

綜上所述，精漿中miR-145 在男性不育癥患者中明顯上調(diào)，且與精子濃度、精子存活率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率呈正相關(guān)，有望作為男性不育癥的輔助診斷指標(biāo)，同時(shí)也為該病的靶向治療提供新的思路。