沈 玲,白 歡,李 麗,汪 玥,龔 路,孫自鏞,陳中舉

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430030）

近些年來，微生物檢驗(yàn)新技術(shù)不斷出現(xiàn)，包括GeneXpert/FilmArray、基因芯片檢測(cè)、高通量測(cè)序技術(shù)（NGS）、MALDI-TOF MS 等。MALDI-TOF MS，即基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜，通過檢測(cè)待檢病原菌株蛋白以獲取其質(zhì)譜峰結(jié)果，同時(shí)對(duì)比龐大的菌株數(shù)據(jù)庫內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)菌株的蛋白質(zhì)譜峰圖譜，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)菌株的鑒定[1]。與傳統(tǒng)微生物鑒定方法相比，MALDI-TOF MS 具有操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、準(zhǔn)確度好、高分辨率等優(yōu)勢(shì)，從而逐漸進(jìn)入臨床微生物實(shí)驗(yàn)室[2]，基于此，目前市面出現(xiàn)了諸多品牌的MALDI-TOF MS 質(zhì)譜分析系統(tǒng)，鄭州安圖生物工程股份有限公司生產(chǎn)的型號(hào)為Autof MS1000 質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)便為其一，然而其儀器性能如何，是否可在臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛推廣，在國內(nèi)尚無報(bào)道。本研究旨在評(píng)價(jià)Autof MS1000 質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)在臨床常見病原菌中的鑒定能力，從而為其能否在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

1.1.1 準(zhǔn)確度評(píng)估：選取華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院2018年6月～2019年6月231 株能夠涵蓋實(shí)驗(yàn)室80%～90%的常見分離菌株和1 株室間質(zhì)控菌株（國家衛(wèi)健委臨床檢驗(yàn)中心1705 二路普雷沃菌，厭氧菌屬）作為檢測(cè)標(biāo)本，其中革蘭氏陽性需氧菌77 株，革蘭氏陰性需氧菌95 株，厭氧菌30 株，酵母樣真菌30 株。

1.1.2 精密度評(píng)估：選取ATCC25922 大腸埃希菌等12 株室內(nèi)質(zhì)控菌株和臨床分離菌株作為檢測(cè)標(biāo)本，其中革蘭氏陽性需氧菌4 株，革蘭氏陰性需氧菌6 株，酵母樣真菌2 株。

1.2 主要儀器及試劑 德國布魯克公司質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)IVD MALDI BIOTYPER 及其配套試劑；鄭州安圖生物工程股份有限公司Autof MS1000 全自動(dòng)微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)及其配套試劑;美國伯樂公司核糖體16S RNA 測(cè)序儀及其配套試劑。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定方法：

1.3.1.1 Bruker MALDI-TOF 質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)鑒定：取凍存菌株傳代兩代至哥倫比亞血平板或臨床分離菌株細(xì)菌均勻點(diǎn)種在靶板各個(gè)孔位內(nèi)，使用直接涂布法或是甲酸涂布法按照儀器操作手冊(cè)操作。

1.3.1.2 Autof MS1000 質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)鑒定：取凍存菌株傳代兩代至哥倫比亞血平板或臨床分離菌株細(xì)菌均勻點(diǎn)種在靶板各個(gè)孔位內(nèi)，使用直接涂布法或是甲酸涂布法按照儀器操作手冊(cè)操作。

1.3.1.3 核糖體16s RNA 測(cè)序：取臨床菌量1ml，采用煮沸法進(jìn)行DNA 提取; 以引物PSL，UNI 進(jìn)行寬范圍PCR 擴(kuò)增16s rRNA（真菌需要把its 區(qū)域保守序列擴(kuò)增）;PCR 產(chǎn)物純化;上機(jī)測(cè)序，測(cè)序儀器：ABI 公司的3500Dx。

1.3.2 儀器評(píng)估方法

1.3.2.1 準(zhǔn)確度評(píng)估：標(biāo)準(zhǔn)菌株和質(zhì)評(píng)菌株為已檢測(cè)菌株，臨床分離菌株已經(jīng)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有鑒定設(shè)備Bruker MALDI-TOF 進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)上述已檢測(cè)菌株在Autof MS1000 質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，評(píng)價(jià)Autof MS1000 鑒定結(jié)果與Bruker MALDI-TOF鑒定結(jié)果的符合性。鑒定可以是屬的水平或種的水平，但對(duì)于關(guān)鍵微生物（如，肺炎鏈球菌），鑒定到種是至關(guān)重要的。有差異鑒定結(jié)果的分離株應(yīng)使用當(dāng)前的Bruker MALDI-TOF 和待評(píng)價(jià)系統(tǒng)（Autof MS1000）進(jìn)行重新檢測(cè)，若依然存在差異則采用第三種方法（核糖體16s RNA 測(cè)序）進(jìn)行確認(rèn)。

1.3.2.2 精密度評(píng)估：選取ATCC25922 大腸埃希菌等12 株菌在Autof MS1000 質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)上進(jìn)行重復(fù)性測(cè)試，每株菌重復(fù)檢測(cè)3 次。

1.3.3 結(jié)果判讀：依據(jù)CLSI M52 對(duì)商業(yè)化微生物鑒定系統(tǒng)（MIS)驗(yàn)證的建議，準(zhǔn)確度超出90%，精密度超過95%即被認(rèn)定為通過[3]。

2 結(jié)果

2.1 準(zhǔn)確度評(píng)估 共納入232 株菌株，其中77 株革蘭氏陽性需氧菌，其中包括葡萄球菌屬20 株，腸球菌屬18 株，鏈球菌屬37 株，其他2 株（棒桿菌屬1 株，李斯特氏菌屬1 株）；95 株革蘭氏陰性需氧菌，其中包括腸桿菌屬46 株，假單胞菌屬7 株，不動(dòng)桿菌屬16 株，莫拉菌屬5 株，嗜血桿菌屬2 株，氣單胞菌屬4 株，伯克霍爾德菌屬3 株，木糖氧化無色小桿菌3 株，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌4 株，其他5株（速生短桿菌1 株，中間蒼白桿菌1 株，腦膜膿毒伊金氏菌1 株，分散泛菌2 株）；30 株厭氧菌，其中包括梭菌屬9 株，擬桿菌屬12 株，普雷沃菌屬2 株，大芬戈?duì)柕戮? 株，遲緩艾格特菌2 株，其它3 株（小韋榮氏球菌1 株，齲齒放線菌1 株，海氏嗜胨菌1 株）；30 株酵母菌。其鑒定符合率為100%，即準(zhǔn)確度為100%。因鑒定結(jié)果均一致，故未使用到測(cè)序方法做確證試驗(yàn)。

2.2 精密度評(píng)估 選取ATCC25922 ECO*，ATCC49247 HIN,A190609196 PAE，ATCC25923 SAU，ATCC22019 CPA，B190608252 SAU，ATCC27853 PAE，A190609045 ECO*，A190607291 SPN**，ATCC49619 SPN**，A190608193 ABA 和F190610024 CAL（*為大腸埃希菌/志賀菌不能區(qū)分的結(jié)果加做吲哚試驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)為大腸埃希菌，**為肺炎鏈球菌需經(jīng)奧普托欣試驗(yàn)作進(jìn)一步確認(rèn))等12 株室內(nèi)質(zhì)控菌株和臨床分離菌株進(jìn)行重復(fù)性測(cè)試，每株菌檢測(cè)的重復(fù)性結(jié)果均為100%，即精密度為100%。

3 討論

MALDI-TOF MS 質(zhì)譜分析技術(shù)近年來發(fā)展迅速，在臨床微生物鑒定領(lǐng)域，憑借其高通量、試劑成本低、操作簡(jiǎn)單、使用菌量少，且可鑒定出某些傳統(tǒng)鑒定方法鑒定菌株種屬困難的優(yōu)勢(shì)，而迅速走紅臨床微生物實(shí)驗(yàn)室，大有取代傳統(tǒng)微生物鑒定方法之趨勢(shì)[2]。

鄭州安圖生物工程股份有限公司生產(chǎn)的型號(hào)為Autof MS1000 的全自動(dòng)微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)基于MALDI-TOF MS 質(zhì)譜分析技術(shù)，主要用于細(xì)菌、酵母樣菌、絲狀真菌、分枝桿菌等菌株的檢測(cè)，具有MALDI-TOF MS 技術(shù)快速、準(zhǔn)確、高通量等特點(diǎn)，同時(shí)擁有超過2 000 菌種數(shù)據(jù)的中國本土化數(shù)據(jù)庫，然而其儀器實(shí)際性能如何，是否可在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室廣泛使用，國內(nèi)尚無相關(guān)報(bào)道。鑒于此，對(duì)Autof MS1000 全自動(dòng)微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)作出適宜的儀器性能評(píng)估顯得尤為重要。本研究主要從儀器性能的準(zhǔn)確度和精密度兩個(gè)最重要的方面來對(duì)Autof MS1000 全自動(dòng)微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室中常見病原菌鑒定能力的評(píng)估。BESSèDE 等[4]使用MALDI TOF MS 鑒定了1 013 株細(xì)菌，其中986 株菌被準(zhǔn)確鑒定到種水平，其種水平鑒定準(zhǔn)確度為97.3%；SENG等[5]運(yùn)用MALDI-TOF MS 鑒定了1 660 株菌，其中84.1%準(zhǔn)確鑒定到種水平，另11.3%準(zhǔn)確鑒定到屬水平，總體鑒定準(zhǔn)確度為95.4%。在本研究中，Autof MS1000 總體鑒定準(zhǔn)確度達(dá)100%，精密度達(dá)100%，性能指標(biāo)明顯優(yōu)于國外相關(guān)的研究數(shù)據(jù)，評(píng)估結(jié)果符合CLSI M52 對(duì)商業(yè)化微生物鑒定系統(tǒng)（MIS)驗(yàn)證建議的要求[3]，亦滿足臨床微生物實(shí)驗(yàn)室對(duì)微生物鑒定的需求，建議可在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室推廣使用。但由于本研究中納入評(píng)估的菌株數(shù)量有限，且基本為實(shí)驗(yàn)室常見菌株，后續(xù)需進(jìn)一步納入大樣本、罕見菌以對(duì)儀器作出更加全面可靠的性能評(píng)估。另外值得特別注意的是，由于MALDI- TOF MS 技術(shù)本身的局限性，對(duì)于一些近緣種及亞種不能進(jìn)行有效的區(qū)分[6]，如在本研究中，大腸埃希菌/志賀菌不能區(qū)分的結(jié)果需加做吲哚試驗(yàn)進(jìn)一

步確認(rèn)為大腸埃希菌，肺炎鏈球菌需經(jīng)奧普托欣試驗(yàn)作進(jìn)一步確認(rèn)，實(shí)驗(yàn)室需充分了解其局限后，在必要時(shí)采用適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充實(shí)驗(yàn)以作進(jìn)一步的區(qū)分。除病原微生物菌種鑒定領(lǐng)域外，隨著MALDI -TOF MS 技術(shù)的不斷發(fā)展，其在細(xì)菌耐藥性方面亦取得諸多新的成果[7]，質(zhì)譜分析技術(shù)在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用前景值得期待。