熊 輝 廣東省深圳市西麗人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（深圳，518055）

沙門菌和志賀菌都是引發(fā)食品中毒的重要致病菌，特別是對(duì)于兒童而言，其危害性非常大，因此這兩種細(xì)菌也成為疾病預(yù)防控制中心對(duì)食品和公共場合工作人員每年定期體檢的必檢項(xiàng)目［1］。 培養(yǎng)法因周期長、操作過程繁瑣、主觀影響因素多、特異性差等原因而無法滿足臨床檢驗(yàn)需求，導(dǎo)致其臨床應(yīng)用存在一定的局限性［2］。 所以，探討一種快速、準(zhǔn)確、有效的檢測方法非常重要也極有必要。 熒光定量PCR 技術(shù)具有操作簡便、靈敏感高、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢而得到廣泛運(yùn)用，盡管當(dāng)前針對(duì)沙門菌和志賀菌的熒光PCR 試劑盒有很多，但大規(guī)模臨床樣本的研究尚未見報(bào)道。 基于此，本研究運(yùn)用雙色實(shí)時(shí)熒光PCR 法對(duì)2700 份臨床肛拭子樣本進(jìn)行沙門菌和志賀菌檢測，并分析其結(jié)果，總結(jié)匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2017 年8 月到2018 年4 月深圳市西麗人民醫(yī)院職業(yè)健康體檢人員臨床肛拭子樣本2700份，運(yùn)用雙色實(shí)時(shí)熒光PCR 法與培養(yǎng)法同時(shí)進(jìn)行沙門菌與志賀菌的檢測。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑。 羅氏熒光定量PCR 儀 （美國Roche 公司），主要試劑包括：PCR Marker（武漢默沙克生物科技有限公司）沙門-志賀菌增菌液（批號(hào)：SSB-1701014D），木糖賴氨酸脫氧膽鹽平板（批號(hào)：XLD-171009D），克氏雙糖鐵（批號(hào)：170914），動(dòng)力-吲哚-尿素酶生化管（批號(hào)：170914），沙門菌顯色平板（批號(hào)：170925-2），沙門菌多價(jià)診斷血清（批號(hào)：20170501）， 志 賀 菌 多 價(jià) 診 斷 血 清 （ 批 號(hào)：20170601），沙門氏菌、志賀氏菌檢測試劑盒（批號(hào)：17090801）。

1.2.2 培養(yǎng)法。將肛拭子樣本置于沙門-志賀菌增菌液中，置于35℃溫箱增菌18～24h，3 區(qū)劃線接種至木糖賴氨酸脫氧膽鹽平板， 置于35℃溫箱增菌18～24h，于木糖賴氨酸脫氧膽鹽平板上篩選出疑似沙門菌和志賀菌的菌落，接種克氏雙糖鐵、動(dòng)力-吲哚-尿素酶生化管及血平板， 作初步的生化鑒定和分純培養(yǎng)，排除一部分非沙門菌和志賀菌后，將其他菌落進(jìn)行革蘭染色、顯色平板培養(yǎng)、菌種鑒定以及血清學(xué)分型。

1.2.3 雙色實(shí)時(shí)熒光PCR 法。以沙門菌和志賀菌的fimY、ipaH 為目標(biāo)檢測基因， 分別對(duì)其進(jìn)行線上序列比對(duì)。 運(yùn)用Primer Premier 5.0 software 系統(tǒng)設(shè)計(jì)沙門菌、志賀菌的引物與TaqMan 探針。運(yùn)用Primer Express 3. 0 software 系統(tǒng)與DNA star 進(jìn)行排序、分析及評(píng)估，優(yōu)化引物、探針、反應(yīng)條件等因素。 將沙門菌、志賀菌的標(biāo)準(zhǔn)陽性菌株用GN 增菌液培養(yǎng)8h后，稀釋成10-4～10-85 個(gè)濃度梯度，分別取50μl 菌液涂HE 瓊脂平板各3 個(gè)，取相同濃度菌液10μl 作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測，統(tǒng)計(jì)平板上長出的菌落數(shù)， 聯(lián)合相應(yīng)的實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測結(jié)果，計(jì)算其準(zhǔn)確率。 檢測過程嚴(yán)格按照試劑盒說明法操作，為了避免因樣品中含有死細(xì)菌而造成假陽性檢測結(jié)果， 使用疊氮溴化丙錠預(yù)處理樣品基因，使死細(xì)胞的DNA 分子與疊氮溴化丙錠發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，以抑制DNA 分子的PCR 擴(kuò)增。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)

陽性標(biāo)本檢測結(jié)果Ct 值小于33，待檢樣Ct 值為33～36，則重新檢測，若Ct 值仍為36 或無Ct 值，則直接報(bào)告陰性。 如果檢出混合標(biāo)本呈陽性，將對(duì)應(yīng)的10 個(gè)標(biāo)本組合分別劃線接種到木糖賴氨酸脫氧膽鹽平板上培養(yǎng)，即再用培養(yǎng)法重做一遍，以確認(rèn)結(jié)果，并以此陽性報(bào)告為依據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPPS 19.0 軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料以%表示， 組間對(duì)比采用x2檢驗(yàn)，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2700 份樣本中，培養(yǎng)法檢出沙門菌與志賀菌陽性分別為2 株、0 株， 檢出率分別為0.07%、0.00%，雙色實(shí)時(shí)熒光PCR 法檢出沙門菌與志賀菌陽性分別為6 株、3 株，檢測率分別為0.22%、0.11%，雙色實(shí)時(shí)熒光PCR 法檢測法的檢出率高于培養(yǎng)法，對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（見表1）。

表1 培養(yǎng)法與雙色實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測法的陽性檢出率對(duì)比[n（%）]

3 討論

沙門菌和志賀菌都是誘發(fā)感染性腹瀉的主要病原菌，血清分型異常之多，沙門菌高達(dá)兩千多個(gè)血清型，因此其分布也較廣［3］。腸炎沙門菌是造成食物中毒的主要病原菌，其他沙門菌血清型還包括豬霍亂、湯普遜等，常通過污染的食物與水源傳播［4］。志賀菌是導(dǎo)致細(xì)菌性痢疾的病原之一，其流行具有變遷性特點(diǎn)，血清型也會(huì)發(fā)現(xiàn)演變與進(jìn)化［5］。當(dāng)發(fā)生感染或食物中毒后，患者經(jīng)治療痊愈后，會(huì)有少部分人會(huì)成為健康帶菌者，因無自覺癥狀，檢查不易發(fā)現(xiàn)，故將其視為慢性或隱性傳染源，此類患者若從事飲食或公共衛(wèi)生場所服務(wù)類工作，則會(huì)對(duì)周邊人群有傳染的可能。

對(duì)于沙門菌和志賀菌的檢測，傳統(tǒng)檢測方法主要為細(xì)菌培養(yǎng)法，這種方法雖然能夠達(dá)到一定的檢測效果，但敏感度不高，而且檢測所需的時(shí)間較長，所需的試劑較多，因此導(dǎo)致其臨床應(yīng)用存在一定的局限性［6］。 國內(nèi)外有運(yùn)用TaqMan 技術(shù)檢測沙門菌和志賀菌的報(bào)道，但常以單一熒光系統(tǒng)檢測單一細(xì)菌，采取同一種方法同時(shí)檢測不同病原菌的報(bào)道則較為罕見。 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR 技術(shù)在細(xì)菌檢測中獲得了廣泛運(yùn)用，并在很大程度上提高了檢測的速度。雙色實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測方法的原理是實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的體外擴(kuò)增，并使用熒光標(biāo)記探針及實(shí)時(shí)熒光PCR 儀采集、分析擴(kuò)增過程信號(hào)。 該檢測方法具有較高的特異性及敏感性，能夠通過儀器對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行熒光信號(hào)檢測，所以在一定程度上提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度［7-8］。雙色實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測方法還能夠?qū)崿F(xiàn)多病原體的同步檢測，省時(shí)省力，操作簡便，且檢測成本較低，能夠大大減少后期細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定的工作量，提高檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確率［9］。操作過程中，盡可能地減少對(duì)玻璃器皿的多次使用，減少清洗、滅菌等環(huán)節(jié)，可大大降低實(shí)驗(yàn)室輔助環(huán)節(jié)污染的風(fēng)險(xiǎn)，繼而提高檢驗(yàn)質(zhì)量。 實(shí)際工作及臨床經(jīng)驗(yàn)表明，雙色實(shí)時(shí)熒光PCR 法在食物中毒的初篩中極少出現(xiàn)漏檢情況［10］，因此，可將其作為國際檢測方法的有力補(bǔ)充。

本研究對(duì)比培養(yǎng)法與雙色實(shí)時(shí)熒光PCR 法在沙門菌和志賀菌臨床檢測中的應(yīng)用價(jià)值， 結(jié)果顯示，雙色實(shí)時(shí)熒光PCR 法檢出這兩種細(xì)菌的陽性率（0.22%、0.11%）均高于培養(yǎng)法（0.07%、0.00%），由此說明，雙色實(shí)時(shí)熒光PCR 法在沙門菌和志賀菌檢測中的臨床應(yīng)用價(jià)值高于培養(yǎng)法。 然而，因?yàn)殡p色實(shí)時(shí)熒光PCR 法的檢測費(fèi)用較高，適合大批量的標(biāo)本篩選，因此目前臨床上依然采用培養(yǎng)法。

綜上所述，雙色實(shí)時(shí)熒光PCR 法檢測沙門菌和志賀菌的臨床效果顯著，具有較高的特異性、敏感度及準(zhǔn)確率，值得臨床推廣與應(yīng)用。