何 飛 汝觸會(huì) 鄭 琦 季也民 徐儉樸 蔡宛如

1 浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 浙江 杭州 310003

2 天臺(tái)縣人民醫(yī)院 浙江 天臺(tái) 317200

3 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院 浙江 杭州 310005

支氣管哮喘是一種具有異質(zhì)性慢性氣道炎癥性疾病，發(fā)病人數(shù)眾多，傳統(tǒng)中醫(yī)藥在支氣管哮喘防治方面具有較好效果[1]，芍藥甘草湯作為著名經(jīng)方之一，目前已廣泛應(yīng)用于臨床，我們前期研究發(fā)現(xiàn)其能調(diào)節(jié)哮喘大鼠Treg/Th17細(xì)胞失衡的作用[2]。本項(xiàng)目運(yùn)用血清藥理學(xué)方法，利用體外實(shí)驗(yàn)觀察芍藥甘草湯含藥血清對(duì)哮喘大鼠T淋巴細(xì)胞凋亡及淋巴細(xì)胞p-Akt水平的干預(yù)作用，以研究該經(jīng)方防治支氣管哮喘的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量250±20g。由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供［動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2013-0016］。飼養(yǎng)條件：恒溫，溫度22±2℃，濕度50%～60%，光照每12小時(shí)明暗交替，換風(fēng)次數(shù)15～20次/小時(shí)。由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心飼養(yǎng)［實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)室許可證號(hào)SYXK（浙）2013-0184］。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處置嚴(yán)格按照浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2 試劑及儀器：芍藥甘草湯由浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室制成流浸膏（芍藥和甘草的比例1∶1）,生藥含量1g/ml；卵白蛋白（Sigma公司，貨號(hào)：SLBB5992V）；氫氧化鋁（Thermo公司，貨號(hào)：77161）；P-AKT抗體（Affinity公司，貨號(hào)：AF0908）；PI3K抑制劑 LY294002（sigma公司，貨號(hào)：19-142）；CO2培養(yǎng)箱（SANYO公司，XD-101）；流式細(xì)胞儀（Becton-Dickinson公司，F(xiàn)ACS Calibur）；酶標(biāo)儀（BioTek公司，ELx800）；核酸電泳儀（北京六一公司，DYY-6B）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法：分述如下。

1.3.1 哮喘大鼠模型建立：SD大鼠（雄性）20只，使用腹腔注射卵白蛋白（OVA）致敏并霧化誘發(fā)建立大鼠哮喘模型，在第1天、第8天分別腹腔注射造模液1ml（含氫氧化鋁100mg、卵白蛋白100mg）致敏。從第15天開始，大鼠裝入霧化容器（30L）內(nèi)，使用1%卵白蛋白激發(fā)液超聲霧化激發(fā)，時(shí)間為30分鐘/天，連續(xù)4周。于末次激發(fā)后處死大鼠，取脾臟以備T細(xì)胞培養(yǎng)所用。

1.3.2 芍藥甘草湯含藥血清制備：取雄性SD大鼠20只，平均分為芍藥甘草湯組與空白組，每日固定時(shí)間灌胃，灌胃前禁水禁食6小時(shí)。芍藥甘草湯組予芍藥甘草流浸膏5g/kg灌胃給藥，空白組給予等劑量生理鹽水灌胃給藥；釆用每天1次，連續(xù)灌胃7天。于第7天腹主動(dòng)脈取血，收集大鼠血液，自然凝固，300rpm離心，收集上層血清，56℃滅活30分鐘，取出后進(jìn)行無(wú)菌過濾，后放入-20℃箱保存，為含藥血清。

1.3.3 哮喘大鼠脾臟原代T細(xì)胞分離和培養(yǎng)：將脾臟剪成10mm3碎塊，置于200目尼龍網(wǎng)上，用一次性注射器內(nèi)芯輕輕碾磨，淋巴細(xì)胞分離緩沖液沖洗；通過密度梯度離心收集淋巴細(xì)胞；將淋巴細(xì)胞分離緩沖液2ml與脾臟細(xì)胞懸液2ml，1：1稀釋后混勻，緩慢加入至含有Ficoll-Paque液試管的液面上，注意保持分層；用吸液管小心將白色的單核淋巴細(xì)胞層吸出重懸浮于RPMI1640培養(yǎng)基重懸培養(yǎng)，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；然后加入尼龍毛柱中孵育60min，除去與尼龍毛結(jié)合的B淋巴細(xì)胞，收集T淋巴細(xì)胞，接種培養(yǎng)瓶，加入適量RPMI1640培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，換液。

1.3.4 分組：哮喘大鼠脾臟原代T細(xì)胞分離和培養(yǎng)后分為6個(gè)組：空白對(duì)照組（10%胎牛血清），陰性對(duì)照組（10%不含藥大鼠血清），芍藥甘草含藥血清分為5%、10%、20%3個(gè)濃度組及 PI3K抑制劑LY294002作為工具藥物的陽(yáng)性對(duì)照組。各組T細(xì)胞使用10%胎牛血清的MEM靜止同步培養(yǎng)24h后，分別加入空白對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清、5%、10%、20%芍藥甘草藥物血清和PI3K抑制劑LY294002的RPMI-1640培養(yǎng)基。

1.3.5 MTT比色試驗(yàn)法檢測(cè)各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按不同組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔，每孔8000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，并分別加入含有對(duì)應(yīng)濃度的血清RPMI-1640培養(yǎng)基，在5%CO2、37℃培養(yǎng)24h。細(xì)胞處理24h后，在每孔中加入10μl的MTT，再置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育3～4h。孵育完成后，吸凈孔內(nèi)液體，再加入200μl的DMSO溶解貼壁細(xì)胞，置于搖床室溫震蕩10min。在λ=490nm采用酶標(biāo)儀測(cè)定各組同一時(shí)間點(diǎn)的OD值，最后進(jìn)行細(xì)胞增殖影響的分析。

1.3.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化接種到6孔板中，次日待細(xì)胞貼壁后，根據(jù)組別，設(shè)置加入相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基，藥物作用后，用0.25%胰酶（不含EDTA）消化收集細(xì)胞；用PBS重懸細(xì)胞2次，2000rpm離心5min，收集5×105細(xì)胞；加入500μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，接著加入5μl的Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15min；再加入5μl的PI染色，輕輕混勻細(xì)胞，于避光條件下室溫孵育10min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況。

1.3.7 流式細(xì)胞儀測(cè)定各組細(xì)胞周期：取細(xì)胞濃度為1×105cells/ml的細(xì)胞懸液，按上述實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞后，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入3ml細(xì)胞懸液，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；將孔板中的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，收集至離心管中，2000rpm離心5min，棄去上清；用2mlPBS液洗滌細(xì)胞沉淀2次；離心去上清，再加入預(yù)冷的70%甲醇1ml，4℃固定4h以上；固定好后，1000rpm離心3min，棄去上清液，再用PBS洗細(xì)胞沉淀 1次，1000rpm離心 3min；加 100μl RNase A 37℃水浴30min；再加入400μl PI染色混勻，4℃避光30min；上機(jī)檢測(cè)，記錄激發(fā)波長(zhǎng)488nm處紅色熒光。

1.3.8 Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞p-Akt磷酸化水平：取細(xì)胞濃度為1×105cells/ml的細(xì)胞懸液接種于96孔板中，根據(jù)組別加入相應(yīng)藥物，共孵育48小時(shí)，提取蛋白后通過Western Blot方法檢測(cè)各組細(xì)胞p-Akt磷酸化水平。使用Gel-Pro32軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不同組間兩兩比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）中的LSD法（最小顯著性法），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT比色試驗(yàn)法檢測(cè)各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況：從表1可知，空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較，兩組對(duì)大鼠T淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)基本無(wú)差別，排除血清這一干擾因素。與空白對(duì)照組比較，5%、10%和20%含藥血清顯著抑制大鼠T淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)（P＜0.01），且呈現(xiàn)劑量依賴性。同時(shí)PI3K抑制劑LY294002陽(yáng)性對(duì)照組與空白對(duì)照組存在顯著差異（P＜0.01）。

表1 芍藥甘草含藥血清對(duì)大鼠T淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況（±s，n=8）

表1 芍藥甘草含藥血清對(duì)大鼠T淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況（±s，n=8）

注：與空白對(duì)照組比較，**P＜0.01。

組別空白對(duì)照組陰性對(duì)照組5%含藥血清組10%含藥血清組20%含藥血清組LY294002組抑制率（%）-1.08±1.30 6.54±2.31**11.49±4.70**23.77±0.83**42.39±0.87**OD值1.15±0.04 1.13±0.01 1.08±0.03 1.02±0.05 0.88±0.01 0.66±0.01

圖1 芍藥甘草含藥血清對(duì)哮喘大鼠T淋巴細(xì)胞凋亡的影響（n=8）

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率：空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較，兩組血清對(duì)細(xì)胞凋亡基本無(wú)差別（P＞0.05），排除血清這一干擾因素。與空白對(duì)照組比較，5%、10%和20%的芍藥甘草含藥血清對(duì)促進(jìn)大鼠T淋巴細(xì)胞凋亡，且呈現(xiàn)劑量依賴性（P＜0.01）。見圖1。

2.3 芍藥甘草含藥血清對(duì)哮喘大鼠T淋巴細(xì)胞周期的影響：空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較，兩組血清對(duì)大鼠T淋巴細(xì)胞周期影響基本無(wú)差別，排除血清這一干擾因素。與空白對(duì)照組比較，5%、10%和20%的芍藥甘草含藥血清組G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加（P＜0.01），10%和20%的芍藥甘草含藥血清組的S期細(xì)胞比例顯著增加（P＜0.01），G2/M細(xì)胞比例顯著減少（P＜0.01）。見表2。

表2 芍藥甘草含藥血清對(duì)哮喘大鼠T淋巴細(xì)胞周期的影響（±s，n=8）

表2 芍藥甘草含藥血清對(duì)哮喘大鼠T淋巴細(xì)胞周期的影響（±s，n=8）

注：與空白對(duì)照組比較，**P＜0.01。

組別空白對(duì)照組陰性對(duì)照組5%含藥血清組10%含藥血清組20%含藥血清組LY294002組G2/M（%）24.28±0.53 23.78±0.30 20.44±0.15**16.49±0.08**13.49±0.42**9.38±0.32**G0/G1（%）40.71±0.38 41.34±1.17 43.80±0.82**45.47±0.40**46.38±0.31**53.15±0.38**S（%）35.19±0.90 34.89±1.03 35.10±0.69 37.70±0.49**40.13±0.57**37.46±0.52*

2.4 各組大鼠T淋巴細(xì)胞中p-Akt磷酸化表達(dá)水平：空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較，兩組的p-Akt磷酸化水平基本無(wú)差別，排除血清這一干擾因素。與空白對(duì)照組比較，5%、10%和20%的芍藥甘草含藥血清組的p-Akt磷酸化水平顯著降低（P＜0.01），而且呈現(xiàn)劑量依賴性。見圖2、圖3。

圖2 p-Akt磷酸化表達(dá)水平

圖3 芍藥甘草含藥血清對(duì)大鼠T淋巴細(xì)胞中p-Akt磷酸化表達(dá)水平的影響（±s，n=8）

3 討論

哮喘的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，其免疫機(jī)制研究越來(lái)越深入。T淋巴細(xì)胞在哮喘的發(fā)病過程中起到了重要作用，它不僅可能參與哮喘慢性氣道炎癥反應(yīng)、氣道重塑和癥狀學(xué)，而且可能在過敏免疫反應(yīng)的啟動(dòng)中起中心作用[3]。細(xì)胞凋亡（apoptosis）是一種機(jī)體為維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而進(jìn)行的程序性死亡，肺內(nèi)淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及氣管平滑肌細(xì)胞及上皮細(xì)胞等細(xì)胞的凋亡異常均參與了哮喘發(fā)病[4]。細(xì)胞周期分為分裂期（M期）和間期，其中間期包括DNA合成前期（G1期）、DNA合成期(S期)和DNA合成后期（G2期），機(jī)體細(xì)胞能否順利完成各階段交替和增殖過程受到嚴(yán)密的調(diào)控，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制后G2/M期比例會(huì)下降。磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)是一種特異性激酶，PI3K/AKT信號(hào)通路參與哮喘的慢性氣道炎癥過程，抑制PI3K可有效減少哮喘氣道炎癥[5]。芍藥甘草湯是“醫(yī)圣”張仲景的經(jīng)典方劑，主要治療傷寒傷陰，筋脈失養(yǎng)所致腿腳攣急等癥。本實(shí)驗(yàn)研究表明，5%、10%和20%含藥血清組能顯著抑制大鼠T淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞凋亡，顯著增加G0/G1期細(xì)胞比例，同時(shí)顯著降低G2/M細(xì)胞比例（P＜0.01），提示芍藥甘草湯能抑制T淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)，通過仰制細(xì)胞DNA的合成及有絲分裂,促使細(xì)胞由G2+M期轉(zhuǎn)至G0/G1期，減少分裂，并促進(jìn)T淋巴細(xì)胞凋亡。另一方面，本實(shí)驗(yàn)表明，與空白對(duì)照組比較，5%、10%和20%的芍藥甘草含藥血清組的p-Akt磷酸化水平顯著降低（P＜0.01），而且呈現(xiàn)劑量依賴性。PI3K抑制劑LY294002亦能顯著降低p-Akt磷酸化水平。提示芍藥甘草湯防治哮喘的作用機(jī)制可能與抑制PI3K、降低T淋巴細(xì)胞p-Akt磷酸化水平，進(jìn)而減少氣道炎癥有關(guān)，但其內(nèi)在機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。